右美托咪定對脂多糖大鼠肺組織NF-κB表達的影響

雷賢英 甘辭海 伍長學 王麗 高曉嵐 胡麗蓉 薛鈺婷 文成麗

西南醫科大學附屬醫院ICU（四川瀘州 646000）

膿毒癥（sepsis）是各種感染導致的全身炎癥反應綜合征，是常見的感染性疾病引起的危重癥，病死率極高［1]。膿毒癥的發病是多因素綜合作用的結果，當機體遭受病原體感染時，機體炎癥效應細胞表面的受體與病原體表面的抗原結合，通過抗原、抗體反應和酶的活化途徑，激活細胞內轉錄因子（核因子NF-κB），最終誘導多種促炎因子以及炎性介質的生成和釋放，導致膿毒癥的發生［2]。有研究表明，右美托咪定具有顯著的器官保護作用［3]。該實驗以右美托咪定進行干預，研究其對早期膿毒癥大鼠大量炎癥反應的調控點NF-κB蛋白在肺組織中表達的影響，探討右美托咪定在膿毒癥救治中的作用機制，為膿毒癥的治療尋找新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年健康雄性Wistar大鼠共40只（西南醫科大學SPF實驗動物中心提供，動物實驗使用合格證號：SYXK（川）2013-065），體質量200～250 g。均飼養在SPF級環境中，室溫20～24℃，相對濕度40%～70%。飼喂全價顆粒料，自由進食和飲水。實驗前均禁食6 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 復制模型及藥物處理運用隨機數字表法將40只大鼠分為5組（n=8），分別為對照組（生理鹽水組）、膿毒癥組（LPS）、右美托咪定低劑量組（D+L）、右美托咪定中劑量組（D+M）、右美托咪定高劑量組（D+H）。采用22號留置針經清醒大鼠尾靜脈穿刺置留置針行尾靜脈保留置管，肝素水封管，用絲線固定以備給藥。對照組：1 mL/kg注射0.9%生理鹽水；LPS組：以5 mg/kg注射脂多糖復制膿毒癥大鼠模型（要求10 min以上注射完）；右美托咪定高/中/低劑量組：在5 mg/kg注射脂多糖建模成功后，隨即泵注負荷劑量右美托咪定（6.5μg/kg，要求10 min以上泵完），然后分別按照4.5、1.5和0.5μg/（kg·h）的速度持續泵入右美托咪定，泵注6 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取肺組織備用。

1.2.2 標本采集40只大鼠均在6 h后用1%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉處死，在無菌條件下取下部分肺組織，進行免疫組織化學和免疫印跡法行NF-κB相關分析，并在顯微鏡下觀察肺組織顯微結構的改變。

1.2.3 檢測指標和方法

1.2.3.1 免疫組化法實驗步驟（1）將肺組織切片進行HE染色以及顯微結構的觀察：所有標本經過40 g/L甲醛溶液固定，梯度脫水及浸蠟，包埋，5μm連續切片后烤干、再經脫蠟、HE染色、透明和封片；（2）肺組織NF-κB蛋白表達：制備肺組織切片（片厚3μm）。采用二步法進行免疫組織化學染色，染色按照試劑盒說明書上的步驟進行操作，肺組織切片進行常規二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后微波熱修復抗原，再用3%過氧化氫滅活內源性酶，封閉血清，滴加一抗（稀釋度為1∶300）后4℃過夜，再滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應時間，以陽性產物棕黃色為度，蘇木素進行復染，脫水明中性樹脂封片，用顯微鏡觀察照相。每一標本隨機選取1張切片，在高倍鏡（×200）下隨機地選擇5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析并計算陽性區平均光密度值（MOD）。MOD=積分光密度值（integrated optical density，IOD）/面積，所得數據取均值后分析統計。

按SP試劑盒說明書進行操作，觀察細胞漿顏色，細胞漿被染成棕黃色的為表達陽性，在每張切片上計數200個細胞，然后計算陽性細胞所占比值（A）。計算方法：陽性率（A%）=陽性細胞數/200×100%，每組觀察5張切片，重復進行5次，得到的數據取均值后進行統計分析。

1.2.3.2 免疫印跡法實驗步驟把碾磨的肺組織粉末加入冰預冷的RIRA裂解液中提取總蛋白，用Bradford法進行定量，按照每孔20μg上樣量進行SDS-PAGE（分離膠濃度：10%，濃縮膠濃度：5%），經濕轉膜后加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入含2%脫脂奶粉的TBST稀釋一抗NF-κB p65或β-actin，置于4℃下振蕩孵育過夜；經TBST洗滌后，再與HRP標記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）進行室溫振搖孵育2 h，再經TBST洗滌后，加入ECL發光顯示液于全自動凝膠成像分析儀上進行曝光，得到的圖像用Gel-Pro analyzer4.0軟件進行條帶灰度分析后計算出目的蛋白與β-actin灰度比值。

1.3 統計學方法所有結果都以均數±標準差表示，所有數據都采用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理。不同組間采用單因素方差分析進行比較，若組間差異存在著顯著性，進一步采用Student-Newman-Keuls法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織HE染色與免疫組化檢測NF-κB表達情況將肺組織進行HE染色和免疫組化染色后光鏡下觀察。對照組：未見AGEs陽性細胞（圖1①），肺泡壁薄，支氣管和肺泡上內皮細胞結構均完整，未見炎性細胞浸潤（圖1②）。LPS組：見大量的AGEs陽性細胞（圖1③），支氣管和肺泡上內皮細胞結構均紊亂，肺泡壁增厚，肺泡壁和肺間質可見大量炎性細胞浸潤，伴明顯充血水腫和片狀出血壞死灶（圖1④）。低劑量、中劑量組：見較多AGEs陽性細胞（圖1⑤，⑦），肺泡壁有輕度增厚，部分肺泡內可見出血、水腫，少量炎性細胞和紅細胞浸潤（圖1⑥，⑧）。高劑量組：見少量AGEs陽性細胞（圖1⑨），支氣管和肺泡上內皮細胞結構較完整，肺泡壁和肺間質輕度增厚，少量炎性細胞和紅細胞浸潤（圖1⑩）。

圖1 肺組織HE染色與免疫組化檢測NF-κB表達（×100）Fig.1 The expression of NF-κB by HE staining and immunohistochemistry

2.2 免疫組織化學檢測肺組織NF-κB蛋白量表達膿毒癥組（LPS組）NF-κB蛋白的表達明顯，右美托咪定高劑量組（D+H組）NF-κB蛋白的表達減少。經統計學分析，LPS組肺組織平均光密度（MOD）值與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。D+H組肺組織MOD值與LPS組比較明顯減少，差異有統計學意義（P＜ 0.05）（表1）。LPS組肺組織陽性細胞所占值（A%）與對照組組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。高劑量組（D+H組）肺組織的陽性細胞所占值（A%）與LPS組比較明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 2）。

2.3 免疫印跡法檢測肺組織NF-κB蛋白表達情況如圖2，β-actin片段的大小趨于一致，均清晰且無雜帶。各組蛋白都有較強的actin條帶出現，表明每組樣品的蛋白總濃度相近，并且各組actin條帶的亮度相似。在實驗組中，LPS組的NF-κB條帶明顯增強，各治療組中，D+H組條帶亮度稍弱，D+M/D+L治療組NF-κB條帶亮度變化不明顯。

表1 肺組織NF-κB蛋白的表達平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

表1 肺組織NF-κB蛋白的表達平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

注：與對照組比較，*P=0.001；與LPS組比較，△P=0.014

分組 樣本量 視野/切片MOD對照組LPS組D+L組D+M組D+H組8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 0.048 8±0.008 8 0.072 0±0.008 4*0.066 0±0.008 9 0.064 0±0.008 9 0.056 0±0.011 4△

表2 各組肺組織NF-κB蛋白的表達（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

表2 各組肺組織NF-κB蛋白的表達（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

注：與對照組比較，a P=0.004；與LPS組比較，b P=0.027

分組 樣本量 視野/切片A%對照組LPS組D+L組D+M組D+H組8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 25.274 0±5.774 1 36.488 0±5.559 4a 30.196 0±4.851 8 30.572 0±5.486 0 28.175 0±5.860 3b

圖2 Western blot檢測肺組織NF-κB結果Fig.2 The results of NF-κB in lung tissue by Western blot

3 討論

在機體受到病原體感染時，機體炎癥效應細胞表面受體識別病原體表面的抗原，再通過一系列抗原、抗體反應及酶的活化途徑，進而激活細胞內轉錄因子（如NF-κB），最終誘導炎性介質及多種促炎因子的生成和釋放［4]。這些炎性介質和促炎因子通過正反饋形式形成引發瀑布效應和細胞因子風暴，級聯擴大機體炎癥反應，從而導致膿毒癥的發生［5]。

急性肺損傷是引起膿毒癥患者死亡的最重要原因之一，其發生時間最早，發生率最高［6]。

肺組織的炎癥高反應性被認為是膿毒癥時病理生理反應的組成部分之一，其中引起促炎因子上調和炎性細胞浸潤是膿毒癥發病機制的關鍵所在［7]。有實驗研究發現，在創傷性休克所致的急性肺損傷動物模型中，組織或細胞NF-κB活性明顯增強，血液和肺泡灌洗液中的炎癥介質如IL-6、TNF-α等的含量明顯增加，實驗結果顯示，嚴重膿毒癥時，通過激活NF-κB，進而啟動TNF-α等炎性因子的大量釋放，最終導致嚴重膿毒癥血清干預離體培養肺血管內皮細胞的損傷［8]。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）與阿片類藥物的不同之處是其基本不會引起呼吸抑制，主要通過作用于腦組織藍斑核中的α2受體，參與鎮靜、催眠和呼吸的調節［9]。有觀察顯示，給予正常志愿者DEX后，其呼吸類似于自然睡眠呼吸狀態，而給予進行人工輔助呼吸的患者DEX后，其高碳酸血癥的發生率明顯降低，可維持良好的每分鐘通氣量，其呼吸抑制閾值和呼吸暫停次數也明顯降低［10]。GEZE等［11]的研究顯示，在氣腹前預給DEX可明顯減少中性粒細胞浸潤及肺組織缺血修飾性白蛋白的產生，從而減輕因氣腹引起的肺損傷；而使用高劑量DEX后能明顯改善高潮氣量通氣模式（HVT）所致呼吸機相關性肺損傷的肺炎癥反應，從而減輕肺水腫發生［12]。GU等［13]的實驗研究顯示，DEX可通過激活α2受體依賴和非依賴雙重機制減輕腎缺血-再灌注損傷所致的遠端肺損傷。另有研究將氯胺酮和DEX聯合應用于失血性休克大鼠模型中，其結果顯示，急性肺損傷的發生率明顯減少，呼吸機相關性肺損傷的發生率及嚴重程度明顯下降，具有明顯的肺保護作用［14]。

基于右美托咪定的抗炎和肺保護效應，本研究通過免疫組化法對肺組織NF-κB蛋白進行檢測顯示：與膿毒癥組比較，高劑量DEX組肺組織NF-κB蛋白平均光密度（MOD）值明顯下降（P=0.014），該組肺組織NF-κB蛋白表達量明顯減少（P=0.027）；通過免疫印跡法亦顯示高劑量DEX組肺組織NF-κB蛋白表達條帶明顯減弱；光鏡下高劑量DEX組可見支氣管和肺泡上內皮細胞結構較完整，肺泡壁和肺間質輕度增厚，少量炎性細胞和紅細胞浸潤。用中、低劑量右美托咪定干預處理后，肺組織NF-κB蛋白表達量有一定程度的下降，但變化不明顯（P＞0.05）。這一系列的實驗結論均證實，高劑量DEX可干預早期膿毒癥大鼠大量炎癥反應的調控點NF-κB蛋白的表達，高劑量DEX對膿毒癥大鼠急性肺損傷有明顯的保護作用。

因此，高治療劑量4.5μg/（kg·h）的右美托咪定可減少早期膿毒癥大鼠肺組織NF-κB蛋白的表達量，進而抑制下游炎癥因子的釋放，緩解肺損傷，具有肺保護的作用。