RIP1/RIP3通路在大鼠急性腦梗死中的作用

鐘春榮 符傳藝 楊杰

1中南大學湘雅醫院神經內科（長沙 410008）；海南省人民醫院2保健中心四區，3神經外科（海口 570311）

急性腦梗死（acute cerebral infarction）常見于腦血栓形成及腦動脈粥樣硬化等原因，引發腦血管狹窄，血流減少，嚴重者腦血管閉塞，進而出現局灶性腦缺血，引起相應支配區域的腦組織壞死［1-2]。急性腦梗死具有高致殘率、高病死率及高復發率特點，神經挽救及功能康復不甚理想，因此，研究并闡釋急性腦梗死神經元死亡的病理生理過程及其調控是治療的關鍵點。神經元死亡包括自噬、程序性壞死及凋亡等方式，隨著研究深入，發現程序性壞死在急性腦梗死中扮演著重要的角色［1]。另外研究表明，RIPs是受體相互作用蛋白（receptor interacting proteins），其活化可參與調控細胞程序性壞死，抑制其產生炎癥反應，尤其是RIP1/RIP3通路發揮著關鍵作用［3-4]。因此，本課題組通過制作大鼠急性腦梗死模型，研究RIP1/RIP3表達及其對炎癥反應的影響，探討程序性壞死信號通路RIP1/RIP3在急性腦梗死中發揮作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g，平均（180±20）g（由中南大學實驗動物中心提供）。大鼠飼養于SPF級清潔動物培養室，溫度22～25℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h日夜光照條件下飼養。

1.2 試劑與儀器羊抗鼠RIP1一抗和羊抗鼠RIP3一抗、HRP標記兔抗羊二抗（武漢博士德生物有限公司），Western blot相關試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（美國R&D公司），Nec-1（美國Alexis生物技術公司），酶標儀（美國BD公司）等。

1.3 方法

1.3.1 動物分組將36只Wistar大鼠正常適應性飼養2周后隨機分為3組，每組12只，分別為急性腦梗死組（采用大腦中動脈阻滯法建立急性腦梗死大鼠模型）、對照組（對照組手術步驟同急性腦梗死組，但不插入線栓）和5-（1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮（Nec-1）組（在急性腦梗死模型建立后，按0.6 mg/kg腹腔注射RIP1特異性抑制劑Nec-1溶液［2]，連續注射7 d）。所有大鼠均在7 d后斷頭取腦組織。

1.3.2 急性腦梗死模型的建立采用改良Longa線栓法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞急性腦缺血模型，采用10%水合氯醛按照6 mL/kg對大鼠進行腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上，依次切開右側頸部皮膚，肌肉，暴露頸總動脈，于CCA分叉處近心側做一切口，插入前端蘸有石蠟的3-0單股尼龍縫線，短暫夾閉翼腭動脈（PPA）以防誤插，栓線經ICA入顱，插入深度約為20 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈起始部的血供。采用Zea longa 5分制評分法評估［5]，如出現行走時身體向偏癱側，并轉圈體征為造模成功。

1.3.3 Western blot檢測海馬組織RIP1和RIP3表達提取各組大鼠右側海馬組織：加裂解液，在冰上裂解細胞15～30 min，5 s×4次超聲破碎細胞，4℃、10 000×g離心15 min，轉移上清至新的Ep管中，蛋白定量后于-20℃保存，用于Western blot實驗。分離蛋白采用10%SDS-PAGE電泳，并將膠用半干轉膜法轉移至PVDF膜，去除非特異性背景采用室溫，5%脫脂奶粉作用，2 h。分別加入一抗1∶1 000，1∶1 500稀釋的RIP1和RIP3單抗，搖床，4℃，過夜，PBST洗滌，室溫，避光條件下加入1∶2 000兔抗羊二抗，孵育30 min，PBST洗滌，化學發光劑顯色1 min，X線片曝光成像，觀察結果。采用蛋白圖像處理系統軟件和Quantity one軟件分別掃描X線膠片和條帶密度測定。分別重復實驗4次。

1.3.4 ELISA法檢測各組大鼠海馬中TNF-α、IL-6表達提取各組大鼠的海馬腦組織準確稱取，加9倍的4℃生理鹽水，經研磨攪拌制成10%的組織勻漿，勻漿完畢冰上靜置30 min以利蛋白充分裂解，制得的勻漿液在4℃，12 000 r/min離心15 min×2次，取上清液。實驗操作步驟按照ELISA試劑盒說明進行。主要操作步驟包括：取出96孔板，加50μL依次稀釋的標準品于相應的反應孔中，制備標準曲線。加50μL待檢樣品于反應孔中。每個樣品做3個復孔。以空白孔調零，在450 nm波長下應用酶標儀測量各孔的吸光度值（OD值）。測定應在加終止液后15 min以內進行。根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.4 統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件分析。計量資料均以均數±標準差（x±s）表示，多組樣本均數的比較應用單因素方差分析。設P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RIP1在急性腦梗死大鼠海馬中的表達與對照組比較，急性腦梗死組海馬組織中RIP1表達增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性腦梗死組RIP1表達，與急性腦梗死組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 RIP3在各組大鼠海馬中的表達與對照組比較，急性腦梗死組中海馬組織RIP3表達增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性腦梗死組海馬RIP3表達，與急性腦梗死組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠海馬中TNF-α和IL-6表達改變與對照組比較，急性腦梗死組中海馬中炎癥因子TNF-α、IL-6表達增加（P＜0.05）；Nec-1可抑制TNF-α、IL-6表達，與急性腦梗死組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖1 RIP1在各組大鼠海馬中的表達Fig.1 Expression of RIP1 in hippocampus of rats in each group

程序性壞死最早由DEGTEREV等［6]發現并命名，是一種有別于壞死但類似細胞凋亡，是可調控的細胞死亡方式，其有ATP含量下降、線粒體水腫破裂、自由基和胞內鈣升高以及炎癥因子浸潤等壞死樣特征，但需要特定的啟動因子促發及調控，其又有凋亡特點。研究發現急性腦梗死可能存在自噬、程序性壞死及凋亡等病理過程［3，7-8]。另外研究表明，RIP1/RIP3是程序性壞死關鍵的調控節點，其廣泛存在于神經元中［4]，在死亡信號TNF等刺激下可通過自體磷酸化，促進程序性細胞死亡發生［9-11]，RIP1/RIP3表達水平與細胞程序性壞死呈正相關。急性腦梗死TNF-α、IL-6等炎性因子高表達，表現為非感染性炎癥［12]，RIP1/RIP3在中樞神經組織放射性損害及血管痙攣缺血后神經組織炎性反應中起著關鍵調控作用［2，13]，因此，筆者推測RIP1/RIP3可能在急性腦梗死中出現高表達，程序性壞死可能是急性腦梗死重要病理過程，并扮演著重要作用。但RIP1/RIP3信號通路在急性腦梗死中的表達和作用尚未見報道。

本研究通過阻斷大腦中動脈制作大鼠急性腦梗死模型，檢測缺血后患側海馬組織中RIP1和RIP3表達，并以海馬TNF-α、IL-6的表達水平作為腦缺血后炎癥應答的指標，判斷急性腦梗死中神經元程序性壞死與炎癥程度的伴隨關系。LIU等［10]研究表明TNF-α誘發大鼠大腦海馬神經元程序性壞死。急性腦梗死發生后，腦組織缺血后產生大量炎性因子諸如TNF-α與IL-6，引發劇烈的炎癥反應，進一步損害腦組織［11]。在本研究中，急性腦缺血大鼠腦梗死側海馬區神經元大量壞死，該區域RIP1/RIP3表達顯著增加，證實了程序性壞死是缺血后神經元死亡的重要方式，伴隨著神經元壞死，生成大量自由基及炎癥因子［14-15]，周圍產生炎性改變。對照組未見TNF-α、IL-6水平升高，程序性壞死與炎癥嚴重程度正相關，急性腦缺血后神經元有氧呼吸鏈中斷，產生大量氧自由基及炎性因子，TNF-α、IL-6是程序性壞死外源性啟動因子，激活RIP1/RIP3信號通道，促發程序性壞死。

SU等［16]研究揭示RIP1拮抗劑Nec-1在大鼠腦室出血模型中有保護作用，研究中發現Nec-1能夠減輕腦組織水腫，抑制炎性因子諸如IL-6、TNF-α產生，且改善大鼠全腦缺血再灌注損傷后的認知和行為能力［17]。本研究中大鼠缺血后經Nec-1處理后，RIP1/RIP3表達水平明顯下降，程序性壞死顯著減輕，伴隨之是TNF-α和IL-6血液中水平下降。因此，筆者認為Nec-1能夠通過阻斷RIP1/RIP3通路，抑制炎癥反應，從而減輕急性腦缺血后神經元程序性壞死，其與出血后神經保護機制有共同的路徑，進一步證實了RIP1/RIP3通路與急性腦梗死的密切關系。

綜上所述，RIP1/RIP3通路參與調控急性腦梗死神經元程序性壞死過程，本研究為急性腦梗死機制和治療的研究提供新的依據和靶點。Nec-1可通過調控RIP1/RIP3通路，抑制炎癥，從而減少神經元程序性壞死。但Nec-1是否同時減輕非程序性壞死或凋亡，尚需要下一步研究證實。