清竅膠囊治療分泌性中耳炎的臨床療效以及相關機制

鐘倫坤 周興瑋 何嫻 朱佳麗 黃秀麗 何騰 孫永東

西南醫科大學附屬中醫醫院（四川瀘州646000）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM），中醫上稱作耳脹、耳閉，是一種由多種病因導致的中耳非化膿性疾病，主要臨床特征為中耳積液、聽力下降，并可引發多種嚴重的并發癥，包括中耳粘連、聽骨壞死等。國內外研究［1]發現，2～7歲發病率最高，約為7.3%～30.7%，2歲左右為高峰，且隨年齡增長而下降。該病治療方法眾多，臨床效果和優缺點各不相同，但目前尚無統一規范的治療藥物。局部切開置管等手術方法有創和治療費用高［2-3]，而且可能引發嚴重的并發癥。目前中醫界正在尋找療效確切并且對全身及局部均有效的中成藥來治療分泌性中耳炎。

清竅膠囊是我院科室獨創治療分泌性中耳炎的經驗協定方藥，經20多年的臨床觀察，效果肯定，成為院內制劑醫保甲類，經10多年的潛心研究，發現其能調節機體自身，改善機體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，并且可提高聽力作用（改善耳蝸微循環），對多種病因的分泌性中耳炎療效確切。本研究旨在通過對清竅膠囊治療分泌性中耳炎的療效以及動物抗炎癥試驗進行更深入的研究，進一步評價清竅膠囊治療分泌性中耳炎的有效性，并了解其抗炎的分子機制，為“清竅膠囊”的新藥開發研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料前瞻性納入我院2014年12月至2015年11月收治的80例分泌性中耳炎患者為研究對象，隨機分為對照組和治療組，每組40例，對照組中男23例，女17例，年齡范圍4～65歲，平均（29.6±5.6）歲；治療組中男21例，女19例，年齡范圍5～67歲，平均年齡為（30.0±5.9）歲，兩組患者在年齡、性別、基礎疾病等的分布上差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

1.2 診斷標準（1）耳痛、耳悶、耳鳴和聽力下降；（2）鼓膜內陷、活動受限和積液征；（3）純音測聽：傳導性聾；（4）聲導抗：鼓室壓圖有平坦型（B型）的典型特征；高負壓型（C型）示咽鼓管功能不良，部分有鼓室積液、鐙骨肌反射消失；（5）鼓膜穿刺抽出積液（對于C型中不能抽出鼓室積液的不納入本研究中）。

1.3 納入與排除標準納入標準：（1）符合以上診斷標準；（2）年齡2～70歲；（3）無嚴重并發癥如鼓室嚴重粘連及硬化；（4）無其他嚴重的全身疾病者；（5）急性分泌性中耳炎（病程3個月內）；（6）簽署研究知情同意書者。排除標準：（1）妊娠期及哺乳期婦女、精神疾病病人；（2）＜2歲或＞70歲患者；（3）有頭孢類藥物過敏史者；（4）因腭扁桃體肥大、腺樣體肥大、腭裂、鼻竇炎、鼻咽纖維血管瘤及鼻咽癌等原因引起的分泌性中耳炎；（5）慢性分泌性中耳炎。剔除標準：（1）無完整病歷資料且無法判斷療效；（2）中途退出觀察，不能判斷療效者；（3）研究病例結束后無法隨者。

1.4 分組方法組1：頭孢克洛膠囊（昆明積大制藥有限公司，批號040103），成人0.5 g/d，每日3次，兒童20 mg/（kg·d），一個療程為10 d。組2：清竅膠囊，成人1.6 g/次，每日3次，兒童按照120 mg/（kg·d）溫熱水吞服，每日3次。共2個療程，1個療程為期10 d。共觀察1～2個療程，觀察期間，兩組均不得使用其它任何藥物（“列入標準”允許的藥除外）。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Characteristics of the patients in the two groups

1.5 實驗動物60只昆明大鼠購自瀘州醫學院動物實驗中心，SPF級，重量18～25 g，耳廓反射靈敏。將其隨機分成3組，分別為對照組、安慰劑組和治療組，每組20只，所有小鼠都通過了耳窺鏡的檢查，結果表明所有小鼠均無外耳道和中耳感染。

1.6 建模方法將1.2 mg卵清蛋白溶于0.6 mL PBS緩沖液配置成溶液，同時使用5.14 mg的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射對照組和清竅膠囊治療組的小鼠，每周1次共2周，此過程為全身致敏階段，2周后，用20%烏拉坦以5 mL/kg的劑量腹腔內注射麻醉小鼠，將15μL配置的OVA/PBS混合液經鼓膜前下方注入鼓室，24 h后再次麻醉小鼠，觀察鼓膜狀態，注射第2次，此為耳內激發階段，建立分泌性中耳炎小鼠模型，造模成功標志參照Pollock HW等的小鼠造模實驗［5]。

1.7 實驗材料、試劑和儀器卵清蛋白（Ovalbumin）為美國Sigma公司生產，小鼠、人HIF-1a、VEGF的ELISA試劑盒均為默克公司產品。清竅膠囊為醫院內制劑，批準文號：川藥制字Z20080310。配方如下：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。酶標儀為美國Promega公司生產。

1.8 療效評價比較兩組電測聽、聲阻抗和不良反應發生率。其中電測聽［6]分別在 500、1 000、2 000 Hz頻率下取平均聽閥，聽力≤26 dB為正常；＞26 dB輕度耳聾；＞41 dB中度耳聾；＞56 dB重度耳聾；＞71 dB是聽力幾乎損失。運用GSl2000 TympstarII型中耳分析儀，226 Hz探測音，分別測試雙耳的外耳道容積、聲順值、峰壓值，并繪制鼓室導抗圖［7]。不良反應［8]：主要為心慌、過敏、白細胞減少、惡心嘔吐等。分別于治療前后用ELISA法檢測兩組患者中耳積液中HIF-1a、VEGF的水平變化。

1.9 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達水平將60只小鼠按照1.5中的方法造模成功后，隨機分為3組，每組20只，分別為安慰劑組、對照組對和治療組，采用ELISA法檢測3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度。

1.10 清竅膠囊對小鼠HIF-VEGF通路信號分子的影響將清竅膠囊內容物配成濃度為0.4 g/mL的溶液，按0.2 mL/10 g體質量灌胃，上、下午各1次。7天為1個療程，連續使用2個療程，對照組按頭孢克洛膠囊內容物配成濃度為0.4 g/mL的溶液，按照0.2 mL/10 g體質量灌胃，安慰劑組同法給予等體積生理鹽水灌胃。ELISA法檢測3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度。

1.11 統計學方法采用SPSS 19.0軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用百分比表示，運用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2結 果

2.1 清竅膠囊對分泌性中耳炎的臨床療效觀察

2.1.1 兩組電測聽和聲阻抗測試治療前兩組電測聽差異無統計學意義（P＞0.05）；經治療后，組2電測聽高于組1（P＜0.05），差異具有統計學意義，見表2。組1和組2各80耳中，B型分別為59耳、57耳，C型分別為為21耳、23耳（負壓水平超過一200 daPa），治療前差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后，組1的80耳中，14耳為As型，5耳為A型，47耳為B型，14耳為C型，組2的80耳中，32耳為As型，4耳為A型，27耳為B型，7耳為C型，兩組耳型分布差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.1.2 兩組不良反應發生率比較組2和組1總的不良反應發生率分別為7.50%和20.00%，組2明顯低于組1，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.2 建模前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達水平的比較與建模前相比，3組在建模后中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達水平顯著升高（P＜0.01），差異具有統計學意義（表5），且3組治療前中耳積液中HIF-1a、VEGF差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組電測聽的對比Tab.2 Comparison of electro-audiometer in the two groups before and after the treament

表4 兩組不良反應發生率比較Tab.4 Comparison of adverse effect in the two groups after the treament 例（%）

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的改變Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的改變Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

注：a與造模前相比，P＜0.05

分組安慰劑組對照組治療組例數20 20 20 HIF-1a（ng/mL）造模前0.51±0.11 0.50±0.12 0.52±0.13造模后6.71±1.11a 6.86±1.30a 6.76±1.18a VEFG（ng/mL）造模前0.42±0.19 0.43±0.18 0.41±0.20造模后5.82±1.19a 5.68±1.12a 5.95±1.48a

2.3 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較如表6所示，3組治療前中耳積液中HIF-1a、VEGF濃度差異無統計學意義，治療后均顯著下降（P＜0.05），且安慰劑組、對照組和治療組上述兩種因子濃度依次降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表6 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

表6 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

注：a與治療前比較，P ＜ 0.05；b與安慰劑組比較，P ＜ 0.05；c與對照組比較，P＜0.05

分組安慰劑組對照組治療組F值P值例數20 20 20 HIF-1a（ng/mL）治療前5.78±1.20 5.86±1.30 5.76±1.18 88.26 0.0014治療后4.68±0.28a 3.16±0.25ab 1.26±0.23abc 41.21 0.017 VEGF（ng/mL）治療前5.44±1.22 5.42±1.21 5.53±1.28 65.17 0.0006治療后4.32±0.24a 3.21±0.26ab 1.67±0.18abc#28.16 0.019

2.4 清竅膠囊對分泌性患者中耳積液中HIFVEGF通路信號分子的影響如表7所示，治療后，2組中耳積液HIF-1a、VEGF濃度均顯著低于治療前，且組2中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度明顯低于組1（P＜0.05），差異具有統計學意義。

表7 兩組治療前后中耳積液中HIF-1a、VEGF分泌量比較Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

表7 兩組治療前后中耳積液中HIF-1a、VEGF分泌量比較Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

注：a與治療前比較，P ＜ 0.05；b與組2比較，P ＜ 0.05

分組組1組2 t值P值例數40 40 HIF-1a(ng/mL)治療前6.63±1.17 6.75±1.38 0.68 0.092治療后3.47±1.04ab 2.28±1.12a 8.16 0.025＊VEGF(ng/mL)治療前6.15±1.27 6.21±1.43 0.27 0.121治療后4.26±1.38ab 2.56±1.03a 10.26 0.021＊

3 討論

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）是臨床上的常見感染性耳部疾病，西醫上總結其病因包括咽鼓管功能障礙、感染、免疫反應等方面。分泌性中耳炎可誘發多種后遺癥，如中耳粘連、鼓膜萎縮硬化、等，影響患者的身心健康。臨床上有多種治療手段，如內科治療包含全身藥物治療（中藥、抗生素，抗過敏藥物）、局部藥物治療；外科治療有鼓膜穿刺抽液、鼓膜切開術等多種手術方法。各種方式針對性強，各有優缺點，有一定療效，但多不理想。目前的各種手術方法因其具有損傷性及痛苦性，無法作為分泌性中耳炎的首選治療方法［2，10]。中醫觀點以為正氣不足，內蘊濕熱，外受風邪，致熱毒墮盛，循肝膽經上沖于耳竅是引起耳張、耳閉的主要原因。

近年來研究發現，IL家族（如IL-1B、IL-2、IL-4等）以及TNF-α、VEGF和HIF-1a等與中耳炎密切相關［11]。同時，較多的學者認為HIF-VEGF信號通路可能為中耳炎發病的重要機制，如SEMENZA等［11]發現在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜HIF-1a、VEGF的基因和蛋白的表達水平明顯升高；重組VEGF蛋白注入鼠的中耳腔用來建立分泌性中耳炎動物模型［12]，HIF-VEGF信號通路在血管增生、通透性增加的過程中扮演重要角色，同時文獻證據顯示其在SOM中耳積液產生方面可能也具有重要作用［13]。但國內鮮有相關報道鮮有。本研究通過建立分泌性中耳炎小鼠模型，發現HIF-VEGF在分泌性中耳炎小鼠模型中的表達明顯升高，與文獻中相符，促使我們更深入的了解分泌性中耳炎模病理及生理機制。

進一步探討清竅膠囊對急性分泌性中耳炎患者的影響，結果表明，清竅膠囊在動物水平和人體水平上均可抑制HIF-VEGF信號通路，治療后HIF-1a、VEGF濃度均顯著下降。此外，與常規治療藥物頭孢克洛相比，清竅膠囊的臨床療效更優，患者聽力顯著提升，同時不良反應發生率顯著較低。這可能主要是因為：清竅膠囊是根據多年的臨床經驗配制而成，可做到標本兼治，延緩中耳分泌液的產生，促進吸收，促使阻塞的咽鼓管逐漸通暢。其發揮藥理作用的特點包括［14]：（1）可明顯提高機體的免疫功能，并促進中耳黏膜排泄和清理；（2）通過改善耳蝸微循環以提高聽力。

雖然本研究結果顯示，經過治療后各組HIF-1a、VEGF濃度未恢復到治療或造模前水平，但已經非常接近。另外，由于本研究周期只有2個療程，相對較短，考慮到中藥起效時間比較緩慢，所以需要今后進行進一步開展多中心大樣本研究，并延長觀察期限進行進一步探討。另外，清竅膠囊在治療分泌性中耳炎的藥理機制可能還涉及其他信號通路，也是未來研究和探討的方向。

綜上所述，清竅膠囊可能通過影響HIF-VEGF信號通路來發揮治療急性分泌性中耳炎的作用，且臨床療效優于頭孢克洛膠囊，值得進一步臨床推廣。