廣東黃酒中氨基甲酸乙酯的研究進展

曹 甜，劉曉艷，白衛(wèi)東，錢 敏，劉功良，劉 露，闕慕儀

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點實驗室，廣東廣州 510225）

我國有著世界上最早的釀酒文化，黃酒更是作為民族代表酒而聞名于世，中國黃酒風味獨特、甘醇爽口，且有著豐富的營養(yǎng)，廣東一帶的婦女在月子期間常用黃酒煮雞肉來滋補身體，深受客家人的喜愛。但廣東客家娘酒中存在著有害物質(zhì)氨基甲酸乙酯（EC）[1]，它是一種2A級的致癌物[2]，對人體健康有著潛在危害，俗話說食以安為先，可見控制黃酒中EC的含量，對黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義[3]。

1 氨基甲酸乙酯介紹及其致癌性

氨基甲酸乙酯，簡稱EC，是一種無色的結(jié)晶[4]，易溶于水、乙醇、乙醚等[5]，結(jié)構(gòu)如下：

在很多發(fā)酵食品中酒類、醬油等中EC都存在[6]。關于EC的致癌性很早就有研究了[7]。

1.1 EC的致癌機理

很多研究學者都關注并探究了EC的致癌機理[8]。EC很容易被人體吸收，會引起皮膚癌、肝癌等，因此對人體健康不利。EC在生物體內(nèi)基本上是在肝內(nèi)發(fā)生分解代謝或是以尿的形式排出，但仍然有微量的EC能被氧化為一種環(huán)氧化物，此環(huán)氧化物會在體內(nèi)形成DNA的加聚物，破壞生物體DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，導致代謝的細胞癌變；或是EC被細胞色素氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，此物質(zhì)通過誘導Cu2+調(diào)控而導致DNA損傷[9]。

1.2 EC的生成機理

相關研究表明，EC的生成機理與黃酒的發(fā)酵原理相關，不同的發(fā)酵方式產(chǎn)生不同的機理[10]，在黃酒中EC的生成最主要的是尿素與乙醇反應[11]，其次是氨甲酰磷酸與乙醇反應、瓜氨酸與乙醇反應。相關學者證實了黃酒中EC的產(chǎn)生基本上都是由乙醇和尿素反應生成的，在黃酒的釀造過程中，原輔料帶入或是在發(fā)酵過程中酵母菌代謝產(chǎn)生的尿素都會造成尿素的積累[12]。

2 氨基甲酸乙酯的檢測方法

EC的檢測方法比較多，從早期開始就有研究，不過研究方法并不成熟，只能定性檢測，隨著儀器的發(fā)展，EC的檢測方法也越來越完善，目前關于EC的檢測使用較多的方法是氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[13]。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法在早期應用廣泛，多用于氣體、易揮發(fā)的液體和某些固體的分析中[14]，而且靈敏度高，可用于測定痕量物質(zhì)，一般mg級的都能檢測到，分析速度快，一般在1 h內(nèi)就能完成一次分析，且操作迅速又簡單。但氣相色譜法難以定性，且只能用于復雜組分的檢測，若沒有標準品的色譜圖對照，則很難判定某出峰時間的色譜峰代表什么物質(zhì)。

2.2 氣質(zhì)聯(lián)用法

GC-MS在氣相色譜法的基礎上能快速高效地對樣品進行定量和定性分析[15]。特別適用于復雜混合物中某組分的鑒定[16]。一般黃酒中的EC檢測采用此法，劉俊等人[17]使用氣質(zhì)聯(lián)用法測定了黃酒中微量EC的含量。研究表明，此方法線性相關系數(shù)0.993 9，回收率為94.65%。

樣品的GC-MC萃取前處理一般采用液液萃取、固相萃取或頂空固相微萃取等方法將EC提取出來，再進行下一步操作。

（1）液液萃取。液液萃取是早期常用的一種樣品前處理方法，利用了溶解度差異來分離組分，一般需使用大量的有機溶劑才能達到目的。對于萃取EC的很多試劑都具有一定的毒性，早期一些學者使用三氯甲烷、無水乙醚等，但由于毒性很強，對人體健康有危害，后來采用CH2Cl2作為溶劑去提取EC，提取效果好，且毒性相對較低，同時對環(huán)境的危害小。林超等人[18]采用液液萃取結(jié)合GC-MS內(nèi)標法測定葡萄酒中EC的含量，以氨基甲酸丙酯為內(nèi)標物，探究了KC 1的質(zhì)量分數(shù)、CH2Cl2的用量、待測溶液的pH值等因素對EC萃取率的影響，得出在樣品pH值保持不變的情況下，KC 1質(zhì)量分數(shù)為40%，CH2Cl2用量為300 mL時，方法的檢出限為8 μg/L，回收率為90.7%～106.3%。

（2）固相萃取。萃取柱內(nèi)的吸附劑吸附樣品中的目標成分，而其他成分則通過其他試劑洗脫下來，達到樣品分離純化的目的。李鳳華等人[19]將樣品經(jīng)硅藻土固相萃取柱凈化，后采用乙醚洗脫，得出EC在10～160 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，最低檢出濃度為4 g/L，回收率為93.3%～111.8%。與早期的LLE樣品前處理方法相比，SPE方法所需的萃取試劑大大減少了，而且萃取率更好。

（3）固液萃取。固液萃取，也叫浸提，使固體樣品中可溶性成分溶解于溶劑中而加以分離的方法。項東方等人[20]將樣品和硅藻土混合均勾，裝入玻璃色譜層析柱中，然后用萃取溶劑洗脫得出EC的檢出限為2.0 μg/L，回收率91.0%～102.0%。此方法與固相萃取相似，具有較高的準確度，萃取柱需要自己制作，不過這樣精密度也更高些。

（4）固相微萃取。固相微萃取一般是將固相微萃取頭纖維暴露于密封的樣品瓶的頂空中，樣品經(jīng)過加熱后，其中的揮發(fā)性氣體部分進入氣相色譜儀分析的方法[21]。劉俊[22]采用固相微萃取萃取EC，丙酸辛酯為內(nèi)標物，將樣品置于50℃條件下進行預熱，5 min后進行萃取45 min，最后解析5 min，黃酒中EC含量能最大程度地降低。這種方法極為簡化、分析速度快，避免了高沸點物或非揮發(fā)性物質(zhì)對分析柱造成超載和污染問題。

2.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

對于分析復雜樣品中的微量EC時，GC-MS法也有一定的局限性，因為一般樣品經(jīng)過前處理后，其所含的EC或多或少都會減少，對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。有研究者探究過GC-MS和GC-MS-MS對酒的測定比較，發(fā)現(xiàn)GC-MS-MS法可以除去GC-MS法中的干擾峰，且可以省去樣品前處理的步驟，更加靈敏、快速。

2.4 液質(zhì)色譜法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 能用于熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)的大分子有機化合物的檢測，此方法發(fā)展時間不長，對樣品的檢測有著高選擇性，在酒類檢測中使用的較少，多用于醬油生產(chǎn)中。

3 吸附氨基甲酸乙酯的材料探究

研究表明，黃酒中EC的直接減除與多種材料有關，如活性炭、硅膠、硅藻土、殼聚糖、PVPP等，其中活性炭與殼聚糖的吸附效果較好，但用活性炭吸附后對黃酒的感官影響也較大，吸附后酒變?yōu)闇\黃色，且酒味較淡；使用殼聚糖吸附對酒體的風味影響不大，但殼聚糖溶解度差，且價格較高；硅膠、硅藻土和PVPP這3種材料吸附效果基本一致，且較低，其中用硅藻土吸附黃酒中的EC后酒體風味也能最大程度地保持，故在黃酒中使用較多，且符合經(jīng)濟效益。

硅藻土的主要成分是二氧化硅，輕質(zhì)多孔、比表面積大、化學穩(wěn)定性高，之所以具有吸附性能主要原因是硅藻土的殼壁由非晶質(zhì)二氧化硅構(gòu)成，殼壁表面具有特殊的微孔結(jié)構(gòu)，這些小孔能均勻吸附各種有機和無機物質(zhì)。運用于食品行業(yè)作為助濾劑是優(yōu)質(zhì)硅藻土的主要用途之一，我國飲料產(chǎn)業(yè)中硅藻土的用量達到其產(chǎn)量的2/3。此外，硅藻土還可以用于吸附凈化等產(chǎn)業(yè)，可用于吸附各種金屬離子、有機化合物和高分子聚合物等。這主要是由于其表面羥基結(jié)構(gòu)的獨特性。硅藻土表面羥基結(jié)構(gòu)使其顆粒表面帶負電荷，在水溶液中呈弱酸性，因此可用于吸附陽離子。我國硅藻土礦產(chǎn)資源豐富，價格低廉，應用潛力巨大。但是硅藻土產(chǎn)地不同，吸附性能差異很大，且天然硅藻土往往因雜質(zhì)含量較高，而使得其應用在許多方面受到限制。這主要是由于雜質(zhì)會造成微孔堵塞，且會占據(jù)硅藻土吸附點位，從而造成硅藻土吸附效果的降低。因此，需要通過提純改性等手段進一步提高其吸附性能。隨著技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多性能優(yōu)良的新型吸附性高分子材料被合成，并在許多行業(yè)中廣泛應用。在黃酒產(chǎn)業(yè)中硅藻土的改性已經(jīng)較為普遍，仲愷農(nóng)業(yè)工程學院白衛(wèi)東經(jīng)過研究堿浸硅藻土對黃酒中EC的去除，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿處理后的硅藻土其去除率提升很高，且處理后酒體的風味與原酒基本一致。

為了能在客家黃酒工廠化生產(chǎn)中，用更好的吸附技術(shù)去除氨基甲酸乙酯，試驗對比分析5種吸附材料，從中挑選出最優(yōu)改性材料和對應的最優(yōu)單因素組合預處理方案。結(jié)果表明，5種原始吸附材料對廣東客家黃酒中氨基甲酸乙酯的去除率依次為硅藻土33.24%，殼聚糖60.89%，交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮24.30%，活性炭52.33%，硅膠25.43%。綜合以上結(jié)果得出殼聚糖的吸附效果最好，但價格較高，硅藻土綜合有優(yōu)勢，故探究了關于硅藻土不同的改性方法，利用堿法改性硅藻土和殼聚糖改性硅藻土，探索其最適改性條件。利用單因素優(yōu)化試驗，從時間、溫度、用量3個單因素出發(fā)，并通過正交試驗對預處理條件進一步優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過堿法改性過的硅藻土加入到黃酒中，吸附去除EC的最優(yōu)條件為反應溫度25℃，反應時間13 h，硅藻土添加量1%。通過試驗所得的改性硅藻土在最優(yōu)處理條件下，氨基甲酸乙酯去除率最大可達78.92%，而未經(jīng)改性的硅藻土對EC的去除率僅為34.53%。而用殼聚糖改性硅藻土后，加入黃酒中進行吸附，經(jīng)試驗篩所得改性硅藻土，吸附效果為原硅藻土的2.24倍，此次試驗所得改性硅藻土材料對黃酒中EC的吸附去除的最優(yōu)條件為反應溫度25℃，反應時間11 h，硅藻土添加量1.2%，得到最佳去除效果為74.74%。

4 結(jié)語

隨著社會的發(fā)展，人們對食品安全的關注度越來越高，黃酒中的EC去除一直是個亟待解決的問題，而且黃酒在國際上的關注也較高，特別是中國黃酒在日本、東南亞有廣泛市場，深受當?shù)厝藗兿矏郏虼私鉀QEC問題的需求也越來越緊迫，應積極采取有效措施，控制黃酒中的EC含量，維護黃酒消費市場穩(wěn)定，盡早為我國黃酒生產(chǎn)消除隱患。