乙酰肝素酶介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的研究

曹洪帥　韓軒茂

[摘要]目的研究硫酸乙酰肝素酶（HPSE）對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞凋亡的影響作用。方法體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，模擬心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（C組）、缺氧/復(fù)氧組（H瓜組）、HPSE抑制劑處理組（OGT2115組）等三組。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞狀態(tài)，MTT法檢測H9C2心肌細(xì)胞存活率。結(jié)果與對照組相比，H/R處理后心肌細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05）；與H瓜組比較，OGT2115處理后可提高缺氧/復(fù)氧后H9C2心肌細(xì)胞存活率（P<0.05）。結(jié)論HPSE抑制劑對缺氧/復(fù)氧后H9C2心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用，拓寬HPSE阻滯劑臨床應(yīng)用范圍，具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。

[關(guān)鍵詞]心肌細(xì)胞；缺氧復(fù)氧損傷；乙酰肝素酶

[中圖分類號]R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B [文章編號]ISSN.2095-6681.2018.05.125.02

硫酸乙酰肝素酶（HPSE）是一種內(nèi)切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳動物細(xì)胞中唯一可以切割細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素側(cè)鏈的酶，參加細(xì)胞外重塑。HPSE涉及多種生理過程如胚胎植入，組織修復(fù)和炎癥過程；病理致病過程主要包括腫瘤的進(jìn)展和腎臟疾病。研究表明，HPSE在多種惡性腫瘤病理發(fā)展過程中呈現(xiàn)高表達(dá)、高活性狀態(tài)，有可能成為一個抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。HPSE作為一個新的靶向治療位點(diǎn)正在逐漸被人們所認(rèn)識。近期發(fā)現(xiàn)，HPSE在大鼠缺血再灌注損傷（I/R）模型中有影響作用，但迄今為止，尚未見缺血過程中心肌細(xì)胞自身HPSE表達(dá)、調(diào)控及凋亡的研究報告。本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷模型，模擬臨床上MIRI，并用HPSE抑制劑進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而探討HPSE對H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的影響作用。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

OGT2115

1.2細(xì)胞

H9C2心肌細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）

1.3試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，胰酶，PBS，胎牛血清，MTT粉末，青霉素鏈霉素混合液，DMSO。

1.4儀器

C02培養(yǎng)箱，熒光倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。

1.5方法

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)

配置培養(yǎng)基：10%胎牛血清（BSA）、1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，置于常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長80%滿時，進(jìn)行細(xì)胞傳代，2～3天傳代1次，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2復(fù)制H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型

細(xì)胞生長80%滿后，將細(xì)胞的培養(yǎng)基換成PBS，置于缺氧裝置中孵育4h（缺氧時間超過時，許多調(diào)亡細(xì)胞團(tuán)漂浮于培養(yǎng)基中，易造成極大誤差，因此本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞缺氧時間定為4h），缺氧處理后更換含10%BSA的DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，模型建立完成。

1.53形態(tài)學(xué)觀察

在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，可以通過觀察細(xì)胞狀態(tài)大致判斷細(xì)胞存活情況。

1.5.4MTT法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，試驗(yàn)組分別加入不同濃度OGT2115（20、40、60、80、100μg/mL）。每組設(shè)4個復(fù)孔。試驗(yàn)組和模型組缺氧培養(yǎng)4 h后，換為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育箱孵育3個小時，對照組不進(jìn)行缺氧復(fù)氧操作。操作完成后，三組細(xì)胞每孔加入20μL的MTT液體（避光），放回細(xì)胞孵箱，孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去全部培養(yǎng)液。每孔加入DMS0150 μL，振蕩5～10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長檢測每孔吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)

正常狀態(tài)下H9C2心肌細(xì)胞呈梭形貼壁生長，細(xì)胞周邊顏色透亮有光澤。衰老死亡的細(xì)胞呈球形且不貼壁懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)對比可以看出HPSE抑制劑處理后可以明顯降低細(xì)胞凋亡率。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞凋亡

MTT法檢測結(jié)果（表1）顯示，正常對照組心肌細(xì)胞存活率97.00±2.34%，H/R模型組為42.91±5.33%，H/R實(shí)驗(yàn)組為60.24±7.61，缺氧處理后H9C2細(xì)胞的相對增殖率明顯下降（P<0.05）。HPSE抑制劑處理后，H9C2細(xì)胞的相對增殖率升高（P<0.05）。

3討論

心肌細(xì)胞凋亡與大部分心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大量研究表明，在眾多心臟疾病中如心力衰竭、心肌梗死等都存在心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變。心肌細(xì)胞凋亡在MIRI發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有資料顯示，I/R是急性腎衰竭和延遲移植功能的重要原因，可通過激活腎小管細(xì)胞的上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而誘導(dǎo)慢性腎損傷，HPSE在其中可能具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HPSE抑制劑在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡過程中起保護(hù)作用。我們課題組借助乙酰肝素酶及其相關(guān)因子在白血病中表達(dá)水平的研究經(jīng)驗(yàn)，采用多種研究方法，研究患者全身及血小板HPSE與心肌缺血再灌注的相關(guān)性；重點(diǎn)研究HPSE對心肌細(xì)胞的纖維化和凋亡的影響，探討HPSE在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病中的作用，及可能的分子機(jī)制，為今后心衰的監(jiān)測、治療及預(yù)后評估開辟新方向，拓寬在其他領(lǐng)域中，HPSE阻滯劑臨床應(yīng)用范圍，具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。

本文編輯：李豆