內質網應激相關活性氧及其機制

孫晶 王巍 田野 田振

[摘要] 內質網（ER）是細胞內的一個精細的膜系統，交織分布于細胞質中，主要負責蛋白合成、修飾、加工及新生肽鏈的折疊、運輸等。改變ER的氧化環境及其內Ca2+含量會導致內質網應激（ERS）誘導的活性氧（ROS）的產生。其中，蛋白質二硫鍵異構酶、內質網氧化還原酶、谷胱甘肽/谷胱甘肽脫水酶、NADPH氧化酶4、細胞色素P450酶、Ca2+及線粒體呼吸鏈蛋白發揮著重要的作用。本文回顧了持續的ERS和蛋白質錯誤折疊引發的ROS級聯及其相關機制。

[關鍵詞] 內質網應激；活性氧；機制

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0042-04

[Abstract] Endoplasmic reticulum（ER） is the major site of calcium storage and protein folding. Alterations in the oxidative environment of ER and also intra-ER Ca2+ can cause the production of ERS-induced ROS. PDI， ERO-1， GSH， Nox4， CYP， Ca2+ and mitochondrial electron transport chain proteins play crucial roles in ERS-induced production of ROS. Here， persistent ERS and protein misfolding-initiated ROS cascades and their related mechanisms will be reviewed.

[Key words] Endoplasmic reticulum stress； Reactive oxygen species； Mechanism

內質網（endoplasmic reticulum，ER）是所有真核細胞分泌途徑的主要細胞器，在細胞中執行多種多樣的功能，包括蛋白質生物合成、折疊、易位和翻譯后修飾（包括糖基化、二硫鍵形成等）[1]。不同的蛋白質完成正確折疊和組裝的時間不同，在指定時間內不能正確折疊的蛋白質會通過泛素-蛋白酶體系進行ER相關降解（ER-associated degradation，ERAD）[2]。許多分子伴侶和酶通過ERAD共同作用來限制ER工作量以促進蛋白質折疊并阻止其聚集[3]。當ER工作量過多時，蛋白質不能達到其天然折疊狀態，導致未折疊蛋白質在ER腔中聚集，這種情況稱為ER應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），它會擾亂細胞的內環境穩態。ERS發生后，細胞會啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）以恢復細胞的內環境穩態[4]。在長期嚴重的ERS下，UPR不再發揮細胞保護作用，而開始產生細胞毒性作用（包括凋亡）。許多證據表明，活性氧（ROS）的產生與ERS之間存在直接聯系[5-6]。UPR期間介導ROS生成的主要酶組分是蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）、內質網氧化還原酶（endoplasmic reticulum oxidoreductin-1，ERO-1）和NADPH氧化酶復合物（特別是Nox4）。此外，線粒體電子轉運酶也會誘導ROS的產生[7]。本文將闡述持續的ERS和蛋白質錯誤折疊，引發ROS級聯反應及其相關機制。

1 二硫鍵形成過程中ERS誘導ROS產生

PDI是ER中必不可少的二硫鍵形成酶。它是細胞中最豐富的蛋白質之一，存在于動物、植物和真菌中。PDI和ERO-1驅動ER中蛋白質二硫鍵的形成。ERO-1借助黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）依賴性反應將電子從PDI經歷幾種硫醇-二硫化物交換反應轉移到分子氧（O2），氧的不完全還原導致超氧陰離子自由基的形成，其可以轉化為過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）或其他ROS，引起ER中蛋白折疊誘發的氧化應激。該電子轉移表明ERO-1可以促進ER內的ROS形成，涉及ERO-1的二硫鍵形成過程對細胞中ROS的總產量有顯著貢獻。如上所述，ERO-1與ER中的蛋白質折疊具有很強的相關性，并且可以觸發ROS產生、促成ERS。

2 Nox4介導的ERS誘導ROS產生

在眾多生成ROS的途徑中，NADPH氧化酶發揮著主要的作用。NADPH氧化酶是具有7個成員的蛋白質家族，包括Nox 1-5和Duox 1和2[8]，其中與ER最具有相關性的亞型是Nox4。除ER外，線粒體、細胞核和細胞骨架等其他位置也存在Nox4。Nox4也涉及ERS誘導的ROS生成。研究表明，與p22phox亞基相關的Nox4使用NADH或NADPH（作為電子供體）來進行氧還原產生超氧陰離子[9]。在由氧合脂質產物7-酮膽固醇或衣霉素引起的ERS狀態下，人血管平滑肌細胞中誘導Nox4表達增多，ROS的產生也隨之增加[10]。而沉默Nox4可以減少UPR誘導的細胞ROS的產生，并且還負責促凋亡和促適應信號，即伴侶的表達[11]。此外，在ERS相關疾病方面，已有研究闡述了在各種ERS誘導的疾病狀況下Nox4在ROS生產中的作用[12-13]。

3 CYP誘導ROS產生

細胞色素P450酶（cytochrome P450 enzymes，CYP）是單加氧酶的一個超級家族，被認為是氧化應激的標志物，多數負責異生素的解毒反應。CYP是ER中電子傳輸鏈的一部分，其構成一系列含血紅素的酶，在許多內源性和外源性化合物的氧化代謝中發揮重要的作用[14]。異生物質侵入時，其代謝過程中CYP對有毒化合物的反應會是ROS的一個重要來源。遇到底物時，CYP與一分子氧相結合后連接到目標化合物上形成氧復合物。氧復合物通過中間反應被還原成過氧化合物，接受兩個質子并產生水，其過程中超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等可能導致細胞損傷的代謝物會被CYP轉化為ROS。CYP通過與其氧化還原伴侶NADPH-細胞色素P450還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase，NPR）以摩爾比為1∶1的形式相互作用來催化這些反應[15]。在底物代謝過程中，電子從NADPH轉移到細胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR），然后由CPR轉移到CYP[16]。從NADPH到CYP的電子轉移的效率或程度低至0.5%～3.0%。NPR和真核CYP之間發生氧化還原循環時所引起的“電子泄漏”在ROS生成中起重要作用。

4 ERS條件下線粒體相關ROS的產生

ERS期間，ER和線粒體可以通過以下方法或因素相互作用。第一個因素是位置，即線粒體和ER之間的緊密靠近，引起兩個細胞器之間物理性的直接相互作用[17]；第二個因素是Ca2+的變化，影響線粒體膜電位三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）消耗和ROS形成[18]；第三個因素是特殊的誘導信號的表達，如Lon蛋白酶，其通過干擾細胞色素c氧化酶復合物裝配/降解來保護線粒體，并且類似地，誘導NIX（調節ER的Ca2+和線粒體膜電位的Bcl-2家族蛋白）表達并開放線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）[19]。因此，由ERS信號引發的ER腔中的氧化應激的爆發作用于線粒體，以進一步增強ROS的產生，以增加胞質Ca2+或消耗ATP的方式，引發線粒體內的氧化磷酸化，使ROS產生最大化。

4.1 GSH在ERS誘導線粒體ROS產生中的作用

已有研究證明GSH在維持ER氧化還原酶的還原狀態中起核心作用[20]，其氧化形式及還原形式之間的比例是氧化還原環境的指示器[21]。在二硫鍵形成過程中，ERO-1被O2氧化，產生H2O2及副產物氧化型GSH。兩者都導致ER腔內氧化還原狀態紊亂，進而引起氧化應激后的ERS[22-23]。GSH的消耗（通過ERS期間的二硫鍵還原）可使線粒體產生ROS，導致細胞死亡[24]。線粒體相關ROS可能進一步增強ERS反應，從而增加線粒體ROS積聚，這是提示嚴重/持續性ERS相關性ROS和線粒體功能障礙的潛在信號機制。因此，哺乳動物和酵母細胞適應應激狀態并增加GSH的合成以降低ROS水平來保持氧化還原衡。

4.2 線粒體呼吸鏈系統在ERS誘導線粒體ROS產生中的作用

線粒體在ERS介導ROS產生中發揮作用，干擾線粒體呼吸鏈可以顯著降低UPR誘導的ROS累積[25]。已有報道表明Ca2+誘導一氧化氮合酶生成一氧化氮（NO），抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ活性，進一步增強線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ中Qo位點的ROS生成[26]。此外，NO及高水平Ca2+可以抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ，誘導MPTP的開放并阻斷復合物Ⅲ、釋放細胞色素c，從而增加ROS的產生。

5 ERS條件下Ca2+相關ROS的產生

Ca2+的釋放/遷移是與ERS條件高度相關的。ERS的早期階段，ROS水平升高導致的氧化應激引起Ca2+通過膜連接通道從細胞外基質流入細胞質或通過ER/肌漿網（sarcoplasmic reticulum，SR）定位的通道從ER/SR進入胞質。細胞質中Ca2+濃度的增加促進Ca2+進入細胞核和線粒體。線粒體Ca2+增加可促進線粒體三羧酸循環和氧化磷酸化，刺激其代謝進而增加ROS的產生。ROS可進一步作為ER的反饋信號，增強Ca2+釋放通道的敏感性，進而增加Ca2+從ER釋放的可能性[27]。此外，ER和線粒體之間物理性相互作用同樣會導致從ER釋放的Ca2+進入線粒體，引起上述反應。當線粒體基質內的Ca2+返回到ER時正向反饋環會衰減。因此，ER/線粒體Ca2+循環對ERS介導ROS產生具有重要意義。

盡管在ER和細胞質中均發生未折疊蛋白質聚集，但在ERS條件下，ROS相關的小蛋白質聚集體比較大的蛋白質聚集體更有害，因為它們結合TATA結合蛋白和cAMP反應元件結合蛋白并損害泛素-蛋白酶途徑。相反，較大的蛋白質聚集體和分子伴侶，如TRiC和HSP70，通過進一步抑制聚集體形成而在細胞中起保護作用。由年齡、突變、特異性或環境因素等因素引起的ERS的失敗可能導致不同的疾病。原理上，氧化蛋白的聚集取決于氧化還原信號傳導介質、抗氧化劑、促氧化劑和蛋白水解活性的平衡，最終提供構象疾病的分子機制。

6 小結

在不同的亞細胞組分中，由于獨特的氧化環境，ER是細胞中最獨特和功能多樣的細胞器之一。在ER相關應激條件下，氧化還原信號傳導介質及線粒體在ROS生成中起關鍵作用。需要進一步的研究來解釋ER和ROS關聯，以完全了解該途徑，闡明它們在生理和病理條件下相互作用的機制。這些信息將有助于更準確和有效地治療或預防ERS相關疾病。

[參考文獻]

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