腦脊液與外周血T—SPOT.TB對結核性腦膜炎診斷價值的比較

宋韜 付洪義 李莉娟

[摘要] 目的 評價腦脊液T-SPOT.TB對結核性腦膜炎的診斷價值。 方法 選取2012年1月～2016年6月河北省胸科醫院結核內科收治的疑診為結核性腦膜炎的147例患者，同時進行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，依據患者的最終診斷，將遴選的133例分為結核性腦膜炎組和非結核性腦膜炎組，比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB的陽性率與陰性率。 結果 所選患者中，結核性腦膜炎76例，非結核性腦膜炎57例。外周血T-SPOT.TB的敏感性為77.63%，與腦脊液的63.16%比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；腦脊液T-SPOT.TB的特異性為98.25%，高于外周血的84.21%，差異有統計學意義（P < 0.05）；腦脊液的T-SPOT.TB的陽性預測值為97.96%，高于外周血的86.76%，差異有統計學意義（P < 0.05）；外周血的T-SPOT.TB的陰性預測值為73.85%，與腦脊液的66.67%比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。當腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC時，診斷結核性腦膜炎的敏感性為90.79%，特異性為98.25%，陽性預測值為98.57%，陰性預測值為88.89%，ROC曲線下面積為0.993（95%CI：0.982～1.000）。 結論 與外周血的T-SPOT.TB比較，腦脊液的T-SPOT.TB可大幅提高對結核性腦膜炎的特異性和陽性預測值，可顯著提高結核性腦膜炎的診斷水平。

[關鍵詞] T-SPOT.TB；結核性腦膜炎；腦脊液；外周血；敏感性；特異性

[中圖分類號] R529.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0050-05

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid for tuberculous meningitis. Methods A total of 147 inpatients of suspected tuberculous meningitis in the Department of TB Medicine of Hebei Chest Hospital from January 2012 to June 2016 were selected. Based on final diagnosis， 133 patients were divided into two groups： tuberculous meningitis group and non tuberculous meningitis group. The positive and the negative rates of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid and peripheral blood were compared. Results Among the patients， there were 76 cases of diagnosed tuberculous meningitis， and 57 cases of non tuberculous meningitis. The sensitivity of T-SPOT.TB in peripheral blood was 77.63%， compared with 63.16% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference （P > 0.05）. The specificity of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 98.25%， significantly higher than 84.21% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive predictive value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 97.96%， higher than 86.76% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The negative predictive value of T-SPOT.TB in peripheral blood was 73.85%， compared with 66.67% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference between the results （P > 0.05）. Taking 96 SFCs/106PEMC as the cut-off value， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and AUROC of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid in diagnosis of tuberculous meningitis were 90.79%， 98.25%， 98.57%， 88.89% and 0.993 （95%CI： 0.982-1.000）， respectively. Conclusion Compared with T-SPOT.TB in peripheral blood， the T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid can significantly improve the specificity and PPV， and accurate diagnosis level of tuberculous meningitis.

[Key words] T-SPOT.TB； Tuberculous meningitis； Cerebrospinal fluid； Peripheral blood； Sensitivity； Specificity

結核性腦膜炎是一種嚴重的繼發性結核病，是結核分枝桿菌引起的顱內非化膿性炎癥性疾病[1]，由于疾病所累及解剖部位的重要性和病理變化的復雜多樣性，決定了結核性腦膜炎是最嚴重的結核病，一旦誤診或漏診，往往會出現嚴重后果，造成較高的死亡率和致殘率[2]。這就需要一種微創甚至是無創、快速而又準確的診斷結核性腦膜炎的方法。T-SPOT.TB以其對結核分枝桿菌獨有的敏感性和特異性被廣泛應用于臨床[3]，目前主要用于外周血的檢測，由于結核分枝桿菌所引起的保護性免疫反應是大量的釋放γ-干擾素的淋巴細胞趨化、聚集至感染部位，因此腦脊液的T-SPOT.TB的結果可能比外周血更準確[4]。本研究在河北省胸科醫院（以下簡稱“我院”）結核內科開展，對疑診為結核性腦膜炎的住院患者，同時進行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB對結核性腦膜炎的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月～2016年6月我院結核內科疑診為結核性腦膜炎的住院患者147例，同時進行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，根據患者的結核菌培養、抗酸染色以及臨床表現、影像學檢查、腦脊液檢查、臨床治療效果，剔除14例不能確診的病例后，將明確診斷的133例患者作為研究對象，分為結核性腦膜炎組和非結核性腦膜炎組。研究對象納入標準：①年齡18～65歲；②有腦膜刺激征或腦神經、脊髓損害表現或顱內壓增高的表現；③抗結核治療4周之內；④簽署知情同意書并經醫院醫學倫理委員會批準。排除標準：①既往有結核病病史、糖尿病、風濕免疫病史及其他肺部疾病史；②合并艾滋病病毒感染；③妊娠；④既往有嚴重肝腎功能衰竭病史，近期（3個月）應用免疫抑制劑及增強劑。分組標準：①結核性腦膜炎組：腦脊液結核分枝桿菌培養陽性或抗酸染色陽性；有發熱、乏力、納差、盜汗、消瘦等典型的結核中毒癥狀，結核菌素皮膚試驗強陽性和/或結核抗體陽性，實驗室檢查（常規、生化）符合結核性腦脊液特點，抗結核治療有效；②非結核性腦膜炎組：實驗室檢查及臨床轉歸均不支持結核性腦膜炎的診斷，可明確診斷為其他疾病，且治療原發病有效。133例研究對象知情同意進行檢測，根據分組標準，結核性腦膜炎組76例，其中男63例（82.89%），女13例（17.11%）；年齡18～64歲，平均（37.6±3.2）歲。非結核性腦膜炎組57例，其中男46例（80.70%），女11例（19.30%）；年齡18～61歲，平均（39.4±4.2）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器

1.2.1.1 主要試劑 （1）無血清培養基：RPMI 1640，PPA laboratory Gmbh。AIM-VTM，Invitrogen公司。（2）PBMCs分離液：LymphoprepTM，Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway。（3）無水乙醇（分析純），上海彤晟化工科技有限公司。（4）PBS緩沖液：1×D-PBS（catalogue number 14040-091），美國GIBCOTM公司。（5）T-SPOT.TB試劑盒，Oxford Immunotec，Abingdon，UK，包括：①微孔培養板：96（12×8）孔，由板條組成，外層披覆有無毒的小鼠抗人的γ干擾素單抗（INF-γ）；②抗原A（0.8 mL/瓶）：其內含有ESAT-6抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；③抗原B（0.8 mL/瓶）：其內含有CFP-10抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；④PHA對照（0.8 mL/瓶）：其內含有用于監控細胞活性的植物血凝素PHA以及牛血清白蛋白和抑菌劑；⑤200倍濃縮的標記抗體（50 μL）：其內含有堿性磷酸酶標記的小鼠的抗人γ-干擾素單抗；⑥顯色底物溶液（25 mL）：其內含有BCIP/NBTplus。

1.2.1.2 主要儀器 二級生物安全柜，美國Thermo Scientific公司。流式細胞儀，美國BD公司，進行PBMCs記數。ELISPOT分析儀，德國ADI公司，進行斑點記數。37℃，90%濕度，5%CO2培養箱，美國Thermo Scientific公司。4℃冰箱BCD-257SL，青島海爾股份有限公司。超大容量低溫離心機，美國Thermo Scientific公司。臺式振蕩器Vortex-Geniez，上海易擴儀器有限公司。電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司。新型全自動恒溫鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司。移液器，美國Thermo Scientific公司。肝素鋰真空采血管（CPT，4 mL），美國BD公司。流式標本檢測管，美國BD公司。細胞計數板，美國HYCOR生物醫學公司。

1.2.2 T-SPOT.TB（ELISPOT法）

采集受試者肝素抗凝腦脊液4 mL和肝素抗凝外周血4 mL，并由研究人員在6 h內完成外周血及腦脊液T-SPOT.TB檢測。T-SPOT.TB檢測以AIM-VTM作為空白對照，植物血凝素（PHA）作為陽性對照，分別以結核分枝桿菌特異性ESAT-6和CFP-10肽段庫作為刺激原。密度梯度離心分離腦脊液和外周血中單個核細胞。在預先包被抗γ干擾素（IFN-γ）單抗的微孔板上，分別加入抗原和腦脊液單個核細胞或外周血中單個核細胞（2.5×109/L），將微孔板置于37℃、90%濕度、5%CO2培養箱中孵育18～20 h，加入二抗及顯色底物，顯色6～8 min。將微孔板置于通風、避光、干燥處過夜，應用酶聯免疫斑點測定法（ELISPOT）分析儀計數斑點，每一個斑點代表一個分泌IFN-γ特異性T細胞。目視法判定標準：陽性對照孔內斑點數≥20個視為實驗有效；陰性對照孔內斑點數為≤5個，任一實驗孔內斑點數-陰性孔斑點數≥6個，認定結果為陽性；若陰性對照孔內斑點數≥6個，任一實驗孔內斑點數≥陰性孔斑內點數×2，認定結果為陽性；若任一實驗孔內斑點數<20個，且陽性對照孔內斑點數≥20個，認定結果為陰性。

1.3 觀察指標

比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB的陽性率與陰性率。計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；陽性預測值=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%；陰性預測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液及外周血的T-SPOT.TB對結核性腦膜炎的診斷效能

76例診斷為結核性腦膜炎的患者中，59例外周血T-SPOT.TB檢測陽性，外周血T-SPOT.TB檢測的敏感性為77.63%；48例腦脊液T-SPOT.TB檢測陽性，腦脊液T-SPOT.TB檢測的敏感性為63.16%，二者差異無統計學意義（χ2=3.82，P > 0.05）。見表1。

57例為非結核性腦膜炎的患者中，9例外周血T-SPOT.TB檢測陽性，外周血T-SPOT.TB檢測的特異性為84.21%；1例腦脊液T-SPOT.TB檢測陽性，腦脊液T-SPOT.TB檢測的特異性為98.25%，二者差異有統計學意義（χ2=7.015，P < 0.05）。見表1。

外周血T-SPOT.TB檢測陽性的患者中59例診斷為結核性腦膜炎，9例診斷為非結核性腦膜炎，外周血T-SPOT.TB檢測的陽性預測值為86.76%；腦脊液T-SPOT.TB檢測陽性的患者中，48例診斷為結核性腦膜炎，1例診斷為非結核性腦膜炎，腦脊液T-SPOT.TB檢測的陽性預測值為97.96%，二者差異有統計學意義（χ2=4.566，P < 0.05）。見表2。

外周血T-SPOT.TB檢測陰性的患者中17例診斷為結核性腦膜炎，48例診斷為非結核性腦膜炎，外周血T-SPOT.TB檢測的陰性預測值為73.85%；腦脊液T-SPOT.TB檢測陰性的患者中，28例診斷為結核性腦膜炎，56例診斷為非結核性腦膜炎，腦脊液T-SPOT.TB檢測的陰性預測值為66.67%，二者差異無統計學意義（χ2=0.896，P > 0.05）。見表2。

2.2 腦脊液及外周血的T-SPOT.TB診斷結核性腦膜炎的ROC曲線

在診斷明確的76例結核性腦膜炎患者中，以病原學或臨床診斷標準作為診斷結核性腦膜炎的標準，以釋放INF-γ的T細胞頻數為評價指標繪制ROC曲線，分析診斷結核性腦膜炎的cut-off值。當腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，診斷結核性腦膜炎的敏感性為90.79%，特異性為98.25%，陽性預測值為98.57%，陰性預測值為88.89%，ROC曲線下面積為0.993（95%CI：0.982～1.000）。見圖1。

3 討論

伴隨我國肺結核發病人數逐年增加，結核性腦膜炎人數也不斷增多，結核性腦膜炎早期臨床表現特異性差[5-6]，常被誤診為隱球菌腦膜炎、化膿性腦膜炎或病毒性腦膜炎而延誤治療，即使在抗結核藥物廣泛應用的現代，其病死率及致殘率仍極高，文獻報道為20%～69%[7-9]。目前臨床上常見的檢測方式有結核菌素實驗（PPD實驗）、腦脊液涂片、染色、鏡檢以及外周血血象和影像學檢測等[10-13]。但確診結核性腦膜炎需要腦脊液中結核分枝桿菌培養陽性或者涂片發現抗酸桿菌，但腦脊液中結核菌量極少，陽性檢出率極低，故醫療工作者迫切需要尋找一種新的、微創甚至是無創、快速而又準確的檢測技術，提高結核性腦膜炎的診斷準確性，改善患者預后。

T-SPOT.TB是近年來結核病診斷技術的重大突破。大量實驗數據表明，外周血T-SPOT.TB對結核感染的診斷有較高的敏感性和特異性，但其在不同部位的結核病中敏感性不一，在結核高流行地區特異性不佳，不能區分活動性結核和潛伏結核感染，使其臨床應用受限[14]。由于結核性腦膜炎的發生是結核分枝桿菌及其特異性抗原與致敏的CD4+T細胞為主的相互作用的過程，腦脊液中的各種細胞因子，例如IFN-γ、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）等水平均顯著高于外周血，局部病變呈現隔室化反應[15]，這種反應使得抗原特異性T細胞向病變部位聚集，外周血抗原特異性T細胞數量減少，從而使結核性腦膜炎患者腦脊液中效應T細胞數量與外周血相比可能增高。

目前國內外對腦脊液T-SPOT.TB診斷結核性腦膜炎的研究逐漸增多，韓國的Kim等[16]首先對腦脊液與外周血T-SPOT.TB診斷結核性腦膜炎的價值進行評估，結果顯示腦脊液與外周血T-SPOT.TB對診斷結核性腦膜炎的敏感性為75%和91%。本研究也顯示外周血T-SPOT.TB對診斷結核性腦膜炎的敏感性高于腦脊液，但二者比較無統計學差異。此后Thomas等[17]的研究也表明腦脊液T-SPOT.TB能早期診斷結核性腦膜炎。近期國內李雪蓮等[18]的研究也表明腦脊液T-SPOT.TB診斷結核性腦膜炎的特異性較高，而外周血T-SPOT.TB檢測的敏感性較高，與其他國內既往研究結果[19]一致。本研究也顯示在結核性腦膜炎患者中，腦脊液T-SPOT.TB的特異性和陽性預測值均高于外周血，比較有統計學差異，可見腦脊液T-SPOT.TB能夠更加準確地診斷結核性腦膜炎。這彌補了外周血T-SPOT.TB檢測的不足[20]。目前外周血T-SPOT.TB無法確定一個理想的cut-off值來鑒別活動性結核病和潛伏結核感染，但當腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，診斷結核性腦膜炎的敏感性和特異性均在90%以上。腦脊液的T-SPOT.TB檢測有望彌補外周血T-SPOT.TB特異性偏低的缺點，使其用于結核病高負擔國家對結核性腦膜炎的早期診斷變得可能，但這仍需大樣本量的研究來驗證。

綜上所述，與外周血的T-SPOT.TB相比，腦脊液的T-SPOT.TB可大幅提高對結核性腦膜炎的特異性和陽性預測值，可顯著提高結核性腦膜炎的診斷水平。

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