3種臨床消毒劑殺菌效果和皮膚刺激性的比較研究

武昌俊 蔡 標(biāo) 童 琳 李 舜 戴陳偉 王 超 周秀紅

目前，醫(yī)院常見的致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌以及銅綠假單胞菌等。金黃色葡萄球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，能引起組織器官膿腫和手術(shù)創(chuàng)傷化膿[1]。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，能導(dǎo)致急性胃腸炎和腹瀉癥狀的發(fā)生[2]。白色念珠菌屬真菌類，通過(guò)感染人體和在人體內(nèi)增殖，形成侵襲性真菌感染，導(dǎo)致患者嚴(yán)重感染甚至死亡[3]。銅綠假單胞菌屬革蘭陰性菌，是一種條件致病菌，能引起皮膚、軟組織和呼吸道感染，以及菌血癥等疾病[4]。而醫(yī)院消毒滅菌工作是提高醫(yī)療護(hù)理質(zhì)量的前提和保障，是預(yù)防院內(nèi)感染的重要手段之一[5]。目前，消毒劑已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的常規(guī)消毒滅菌工作中[6]。消毒劑是指能夠殺滅或抑制傳播媒介中的病原微生物的制劑，能夠切斷傳染病的傳播途徑，達(dá)到控制傳染病的目的[7]。目前，醫(yī)院醫(yī)用消毒劑有多種，但作用原理和殺菌效果大不相同。隨著消毒劑的頻繁使用，抗藥菌株不斷出現(xiàn)，需要定期評(píng)價(jià)不同消毒劑的消毒效果。本研究比較臨床上常用3種消毒劑的殺菌效果和皮膚刺激性，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用消毒劑 含乙醇75.4 %的無(wú)色透明液體，pH值為6.5；含有效碘0.51 %的棕色液體，pH值為2.8；含三氯生0.18 %的無(wú)色透明液體，pH值為7.4。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌(ATCC 8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、白色念珠菌(ATCC 10231)、銅綠假單胞菌(ATCC 15442)購(gòu)自安徽艾浮地艾空氣凈化檢測(cè)站，來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)選用健康豚鼠18只，體質(zhì)量為250～300 g，隨機(jī)分為3組，每種消毒劑選用1組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物來(lái)源：南京安立默科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.0032009。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18～28 ℃，相對(duì)濕度為40 %～70 %。

1.1.4 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌)、沙氏培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)白色念珠菌)，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.5 中和劑 細(xì)菌殺滅實(shí)驗(yàn)選用中和劑為1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐溫80的0.03 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(乙醇)；含1 %(W/V)硫代硫酸鈉+1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐溫80的0.03 mol/L PBS溶液(碘伏)；含0.3 %(W/V)硫代硫酸鈉+2 %(W/V)吐溫80+0.5 %(W/V)卵磷脂的0.03 mol/L PBS溶液(三氯生)。有機(jī)干擾物為30 g/L牛血清白蛋白。

1.2 供試菌株的活化 接種供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和銅綠假單胞菌至相應(yīng)的瓊脂試管斜面培養(yǎng)基上，置生化培養(yǎng)箱中37 ℃需氧培養(yǎng)24 h。每個(gè)菌種各取2支斜面供實(shí)驗(yàn)用，其余冷藏備用。

1.3 菌懸液的制備 分別挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和銅綠假單胞菌斜面菌落接種至相應(yīng)的瓊脂平板，置生化培養(yǎng)箱中37 ℃需氧培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，無(wú)菌生理鹽水洗脫菌落，分別制成菌液濃度為107～108cfu/mL的菌懸液，備用。

1.4 中和劑鑒定實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)選擇金黃色葡萄球菌(細(xì)菌)和白色念珠菌(真菌)進(jìn)行中和劑鑒定實(shí)驗(yàn)[8]。實(shí)驗(yàn)分為6組：第1組為消毒劑+菌懸液，第2組為(消毒劑+菌懸液)+中和劑，第3組為中和劑+菌懸液，第4組為(消毒劑+中和劑)+菌懸液，第5組為稀釋液+菌懸液，第6組為稀釋液+培養(yǎng)基+中和劑。具體實(shí)驗(yàn)步驟按《消毒技術(shù)規(guī)范》衛(wèi)生部2002版中懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)程序[8]進(jìn)行。第6組平板菌落數(shù)應(yīng)為0；第1組平板菌落數(shù)應(yīng)為0，或僅有極少；第2組平板菌落數(shù)應(yīng)比第1組多，但應(yīng)比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)≤15 %，組間菌落數(shù)誤差率按下式計(jì)算。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，均符合要求時(shí)，判定所選中和劑及其濃度為受試樣品殺菌實(shí)驗(yàn)適宜的中和劑。

1.5 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn) 在無(wú)菌試管內(nèi)分別加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機(jī)干擾物溶液，再加入受試消毒劑殺菌工作濃度1.25倍的消毒劑(陽(yáng)性對(duì)照為胰蛋白胨生理鹽水溶液)，快速混勻。分別作用至設(shè)定時(shí)間，取混合液0.5 mL加至裝有4.5 mL中和劑溶液的試管內(nèi)，混勻作用10 min，中和殺菌反應(yīng)。選取稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)于19～21 ℃水浴條件下進(jìn)行，重復(fù)上述所有實(shí)驗(yàn)步驟3次。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋涂平板并計(jì)算各組的菌濃度(cfu/mL)，換算成對(duì)數(shù)值，殺滅對(duì)數(shù)值[8]按下式計(jì)算：平均殺滅對(duì)數(shù)值=陽(yáng)性對(duì)照組平均菌濃度對(duì)數(shù)值-實(shí)驗(yàn)組平均菌濃度對(duì)數(shù)值。

1.6 多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 取皮膚正常完好的健康白色豚鼠6只，實(shí)驗(yàn)前24 h背脊部?jī)蓚?cè)各約3 cm×3 cm備皮。將受試消毒液原液均勻涂在一側(cè)脫毛皮區(qū)，無(wú)刺激性塑料膜覆蓋表面，無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定，另一側(cè)脫毛皮區(qū)無(wú)處理，作為陰性對(duì)照。4 h后溫水洗凈殘留消毒劑。每天實(shí)驗(yàn)處理1次，連續(xù)實(shí)驗(yàn)14 d。在每次實(shí)驗(yàn)后24 h觀察皮膚刺激反應(yīng)并進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分方法與刺激指數(shù)計(jì)算方法參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[8]，見表1、2。

表1 皮膚刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)表

按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分(刺激指數(shù))，并以表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。每天每只動(dòng)物平均積分為每只動(dòng)物14 d的紅斑和水腫總積分/(受試動(dòng)物數(shù)×天數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)菌繁殖體以金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌。第1、6組平板菌落數(shù)為0；第2組平板菌落數(shù)比第1組多，但比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數(shù)誤差率分別為6.40 %、4.00 %、5.23 %，乙醇第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)、碘伏第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)、三氯生第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。見表3。

表3 3種消毒劑中和劑鑒定實(shí)驗(yàn)(以金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌)生長(zhǎng)菌落數(shù)結(jié)果

真菌以白色念珠菌作為實(shí)驗(yàn)菌。第1、6組平板菌落數(shù)為0；第2組平板菌落數(shù)比第1組多，但比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數(shù)誤差率分別為12.90 %、8.61 %、8.31 %，乙醇第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)、碘伏第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)、三氯生第3、4、5實(shí)驗(yàn)組間菌落數(shù)誤差率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。見表4。

表4 3種消毒劑中和劑鑒定實(shí)驗(yàn)(以白色念珠菌作為實(shí)驗(yàn)菌)生長(zhǎng)菌落數(shù)結(jié)果

2.2 3種消毒劑懸液定量殺滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果 作用0.5、1 min時(shí)，三氯生對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效果最佳，作用1.5 min時(shí)，乙醇?xì)缧Ч罴眩煌粫r(shí)間點(diǎn)3種消毒劑效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。作用0.5、1 min時(shí)，三氯生對(duì)大腸桿菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；作用1.5 min時(shí)，乙醇?xì)缧Ч罴眩?種消毒劑殺滅效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。作用0.5、1、1.5 min乙醇對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種消毒劑中，三氯生對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最好；乙醇對(duì)銅綠假單胞菌和白色念珠菌殺滅效果最好。見表5。

表5 3種消毒劑懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)平均殺滅對(duì)數(shù)值結(jié)果

2.3 多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3種消毒劑原液連續(xù)對(duì)豚鼠完整皮膚涂抹14 d后，未見皮膚紅斑、水腫等異常反應(yīng)，其皮膚刺激性指數(shù)為0，對(duì)豚鼠皮膚為無(wú)刺激性。

3 討論

乙醇是醫(yī)院最常用的一類消毒劑，醫(yī)用乙醇為無(wú)色澄清溶液，75 %的乙醇溶液殺菌性能最強(qiáng)，但有較大刺激性氣味，少數(shù)人如老人、兒童可能會(huì)產(chǎn)生不耐受性和過(guò)敏反應(yīng)。有研究[9]表明乙醇濃度受溫度的影響較大，冬夏季溫差較大，配制醫(yī)用乙醇時(shí)一般不宜選用。碘伏是目前我國(guó)醫(yī)院消毒和家庭常用的一類皮膚用消毒劑。碘伏又名聚維酮碘，是有效碘與一類表面活性劑聚維酮相結(jié)合而形成的一種絡(luò)合物[10]。碘伏毒性低，具有廣譜的抗菌殺菌作用，對(duì)皮膚黏膜無(wú)刺激。有研究[11]表明使用碘伏對(duì)志愿者前臂內(nèi)側(cè)中段皮膚表面擦拭消毒后，對(duì)皮膚表面自然菌殺滅效果符合我國(guó)消毒規(guī)范要求。三氯生學(xué)名為二氯苯氧氯酚，分子式C2H7Cl3O2，被廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生香皂、消毒洗手液、傷口消毒噴霧劑等消毒領(lǐng)域[12]。

本研究結(jié)果顯示，作用1.5 min時(shí)，乙醇對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最佳；作用0.5、1及1.5 min時(shí)，乙醇對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明乙醇對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌殺滅效果較好，對(duì)細(xì)菌繁殖體和真菌具有良好的殺滅性能，殺菌譜較寬。作用0.5、1 min時(shí)，三氯生對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最佳，且同一時(shí)間點(diǎn)3種消毒劑殺滅效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但對(duì)銅綠假單胞菌和白色念珠菌殺滅效果相對(duì)較差，表明三氯生對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分陰性菌滅效果快速高效，對(duì)真菌殺滅性能較差，殺菌譜較窄。

在本研究中，多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種臨床消毒劑多次皮膚刺激性指數(shù)為0，刺激反應(yīng)強(qiáng)度均為無(wú)刺激性，對(duì)人體安全無(wú)刺激。但在臨床使用時(shí)，應(yīng)注意老人和兒童對(duì)75 %乙醇刺激性氣味的不耐受以及少數(shù)過(guò)敏體質(zhì)人群使用乙醇消毒時(shí)產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)。另外，乙醇易揮發(fā)，濃度受溫度的影響較大，殺菌效果也會(huì)受到影響，盡量做到現(xiàn)配先用，隨用隨配。目前，張鵬等[13]認(rèn)為高濃度的三氯生能直接或間接影響人類的健康，但有研究[14]表明三氯生對(duì)于人類健康影響的研究不足，目前還缺乏對(duì)人體有效的安全評(píng)價(jià)的科學(xué)依據(jù)。所以，在臨床上使用三氯生消毒劑進(jìn)行消毒時(shí)，應(yīng)盡量配制低濃度的三氯生溶液，一般不超過(guò)0.3 %。

綜上所述，三氯生對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最好，乙醇和碘伏對(duì)銅綠假單胞菌和白色念珠菌的殺菌效果優(yōu)于三氯生，臨床上應(yīng)根據(jù)患者情況和殺滅對(duì)象加以區(qū)別選擇。