結直腸癌中葡萄糖轉運蛋白-12作為化療聯合用藥靶點的研究

高 雷 張 帆 孫 麗 李 娜 崔海港

葡萄糖轉運蛋白-12(glucose transporter-12,GLUT12)是葡萄糖轉運體GLUT家族的一員[1],主要分布于脂肪和骨骼肌細胞內，負責葡萄糖的轉運[2]。腫瘤組織新陳代謝率高，對營養物質的需求高。與正常細胞相比，癌細胞對葡萄糖有著更高的需求[3]。癌細胞通過葡萄糖轉運蛋白轉運葡萄糖以滿足細胞營養需求，研究結果似乎能解釋GLUT12蛋白特異性地表達于乳腺癌、前列腺癌以及神經膠質瘤細胞中的現象[4-5]。

目前僅有關于GLUT12在結直腸癌(colorectal cancer,CRC)細胞株HT29中報道[5]，其在CRC組織中的表達和功能尚不清楚。槲皮素(quercetin,QC)是廣泛存在于植物中的一種黃酮類化學成分，對多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、結腸癌、卵巢癌、膽囊癌等均有抑制作用[6]。QC能抑制小腸上皮葡萄糖共轉蛋白SGLT1[7]，對GLUT12等葡萄糖轉運蛋白的作用卻不清楚。為探討能否將GLUT12作為治療CRC的靶點，本文研究了 GLUT12在CRC細胞和組織中的表達情況, 在此基礎上考察了聯合使用QC和奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)對CRC細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人結腸癌DLD-1、HCT-15以及SW620細胞均購自于南京凱基生物有限公司。HIEC-6正常人腸上皮細胞購自于上海江林生物科技有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 OXA(美國Sigma-Aldrich公司，09512)；QC(上海純優生物科技有限公司, 117-39-5)；MTT及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma-Aldrich公司，D2650)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，11012-8611)。DMEM高糖配方培養基(美國Sigma-Aldrich公司, D5546)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(江蘇碧云生物技術研究公司, P0010)。0.5%醋酸結晶紫溶液(實驗室自配)；抗體GLUT12及β-actin(美國Abcam公司, 批號分別為ab75441和ab8226)；其他抗體(二抗)購自于Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA, 批號分別為sc-516132，sc-516192)。EZ-10 DNAaway (上海生工公司, B618133)。

1.1.3 實驗儀器 CO2培養箱(美國Bio-Rad公司)；NUAIRE生物安全柜(美國Nuaire公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；NIKON Eclipse熒光顯微鏡(日本NIKON公司)；Spectra Max M2 多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Chemi doc XRS凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；Mini-PROTEAN Tetra轉印系統(美國Bio-Rad公司)；T100型pcr基因擴增儀(美國Bio-Rad公司)；低溫冰箱(美國Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人結腸癌DLD-1、HCT-15和SW620以及正常人腸上皮HIEC-6細胞接種于T25培養瓶中，種植密度為每瓶約1×106細胞。細胞培養于含DMEM的高糖培養基中(含10% 胎牛血清，青霉素-鏈霉素1×105U/L，2.0 g NaHCO3)培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱里進行培養，每隔3～5 d換培養液，并仔細觀察細胞的生長狀況。當細胞生長密度達到80%～90%時，用胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 腫瘤組織的采集、存放及處理 采集20例CRC患者的腫瘤組織，試驗經由倫理委員會批準，所有患者實驗前均簽訂知情同意書。患者年齡50～70歲，未經過放化療，未有長期服用其他藥物的歷史，肝腎功能等指標也處于正常范圍。采集的腫瘤組織全部經過病理技師確認。采集的腫瘤或者周圍的正常組織大小為2～3 cm，組織采集后立即用冰生理鹽水沖洗，冷凍并存放于液氮中。免疫組化前，所有樣本解凍并經專業的病理技師進行石蠟包埋處理。

1.2.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測 GLUT12基因表達 按1.2.1中所述條件傳代培養人結腸癌DLD-1、HCT-15、SW620及正常人腸壁HIEC-6細胞。細胞生長密度達到80%～90%時，加入細胞裂解液裂解細胞，用EZ-10 DNAaway試劑盒提取細胞總RNA。用NANOdrop測量RNA含量及純度。根據EZ-10 DNAaway試劑盒說明書，A260/A280>1.8被認為是合格樣品。將總RNA用逆轉錄試劑盒合成模板單鏈cDNA。以cDNA為模板，對合成的cDNA進行PCR，PCR條件設定為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，75 ℃ 30 s，循環進行35次。所得PCR產物經海藻糖凝膠電泳分離，紫外條件下可視化處理并拍照記錄產物條帶，使用IMAGE J 軟件 (美國)分析條帶的強弱，以各種癌細胞株中GLUT12表達強度值和正常HIEC-6細胞中GLUT12表達強度值的比值表示GLUT12 PCR產物在該細胞中的表達強弱。

1.2.4 免疫組化法檢測腫瘤組織中GLUT12蛋白表達 將含有腸癌組織的石蠟切片在二甲苯和不同濃度的乙醇水溶液中進行脫蠟和脫水處理。然后，將切片置于含有3%的H2O2的溶液中，室溫孵育30 min后，在高壓鍋中進行抗原修復。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)水洗3次，每次10 min。GLUT12一抗(Abcam: ab75441)4 ℃ 過夜孵育，PBS水洗3次，每次10 min。添加辣根氧化酶標記的二抗(Santa Cruz: sc516132)室溫孵育2 h后，PBS水洗5次，每次5 min。滴加二氨基聯苯于組織切片上，顯色反應須控制在1 min之內完成。然后水洗玻片10 min，蘇木精復染5 min，乙醇梯度脫水，透化，封片，光學顯微鏡下鏡檢。采用盲法對染色的切片進行打分[8]，0分為染色陰性，1分為染色較弱，2分為中等強度表達，3分為較強表達，4分為最強表達。

1.2.5 免疫熒光法檢測細胞GLUT12蛋白表達 將人結腸癌DLD-1細胞種植于含有圓形蓋玻片的24孔細胞培養板中。2～3 d后，細胞密度達到60%～80%時，用不含葡萄糖的DMEM培養基孵育4 h，分別加入5、10 mM葡萄糖作為處理組，加入10 mM葡萄糖+5 mM QC作為共同培養組，對照組只加培養基。共同孵育6 h后，吸掉舊培養基，加入冰冷的PBS溶液終止反應。每孔細胞用冷的4%的多聚甲醛固定15 min后，用含有0.2%的Triton X-100透化。透化后，每孔細胞加入Image-iTTMFX熒光信號增強劑(美國Life Tech)。用含有3%羊血清及2%牛血白蛋白的封閉劑封閉1 h，細胞與GLUT12一抗(Abcam: ab75441)孵育1 h，再與紅色熒光素標記的二抗(Santa Cruz: sc-516192 )孵育2 h。清洗殘余抗體后，將細胞轉移到載玻片上，用含有熒光保護劑和細胞核染色劑Vectashield封閉。倒置熒光顯微鏡下，檢查細胞熒光強度并拍照。ECL顯影后，用GELDOC2000凝膠成像系統采集圖片。

1.2.6 蛋白印記法檢測GLUT12蛋白含量變化 用含有不同濃度葡萄糖(5、20、100 Mm)或抑制劑(10 mM)的培養基孵育人結腸癌DLD-1細胞6 h后，選用提取蛋白試劑盒提取細胞總蛋白，再用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量試劑盒進行定量。選用適合濃度的分離膠和濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后選用硝酸纖維膜轉移蛋白，再用5%的脫脂奶粉室溫封閉4 h，含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution with tween-20, PBST) 洗3次，每次10 min，GLUT12一抗(Abcam: ab75441)在4 ℃冰箱孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，再加辣根過氧化物酶標記的二抗(Santa Cruz: sc516132)稀釋液室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min。可視化處理并拍照記錄凝膠中產物條帶, 使用IMAGE J 軟件 (美國)分析條帶的強弱，以各種癌細胞株中GLUT12表達強度值和正常HIEC-6細胞中GLUT12表達強度值的比值表示GLUT12在該細胞中的表達強弱。

1.2.7 MTT比色法檢測細胞活力 胰酶消化生長旺盛的DLD-1和SW620結腸癌細胞，稀釋成5×107/L的細胞懸液。用排槍接種于96孔培養板中，每孔含100 μL細胞懸液，每個藥物處理組設置4個重復孔。細胞過夜貼壁后，用排槍吸棄舊的細胞培養液，根據向培養孔中添加含有不同濃度OXA或者GLUT12抑制劑的培養液200 μL。實驗分別分為空白組，槲皮素組 (Q, 濃度為 5 mM)， OXL組 (OXA，濃度為10 μM),和OXL與槲皮素聯合組 (OXL+Q：OXA濃度為10 μM, 槲皮素濃度為 5 mM)，空白組只添加相同體積的培養液。CO2培養箱中持續孵育72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續孵育2 h后，用排槍輕輕地吸取培養液，加入200 μL DMSO用以溶解紫色結晶，持續震蕩15 min后，使用酶標儀在490 nm條件下測量各孔的吸光度。對照組加入不含藥物的等體積細胞培養液。實驗重復3次后，按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(藥物處理組吸光度/對照組吸光度)× 100%。

1.2.8 腫瘤細胞集落生成實驗(colony forming assay,CFA) 將結腸癌DLD-1細胞種植于6孔培養板中，每孔600細胞。24 h后，每孔細胞加入含有各種濃度藥物的培養基，實驗分別分為空白組、槲皮素組(Q,濃度為 5 mM)、OXL組 (OXA，濃度為5μM)和OXL與槲皮素聯合組 (OXL+Q：OXA濃度為5 μM, 槲皮素濃度為5 mM)，空白組只添加相同體積的培養液。連續培養14 d。期間單個細胞會分化成由多個細胞所組成的細胞集落。培養結束每孔細胞用2 mL溫熱的PBS輕柔潤洗后，加入2 mL 0.5%結晶紫溶液，輕柔震蕩5 min，用PBS輕輕漂洗3次后，細胞集落會被染成藍色的顆粒狀可見物。人工清點細胞組成>50的細胞集落數目。使用Image J軟件中的粒子直徑分析功能計算各個培養孔中的細胞群落的平均直徑(軟件默認為任意單位)。

2 結果

2.1 GLUT12基因在CRC中的表達 GLUT12基因在3種癌細胞株中均有表達，在DLD-1細胞株中的表達含量最高，為(3.5±0.7)，在SW620、HCT-15細胞株中的相對含量分別為(3.1±0.2)和(2.6±0.4)。另外，與DLD-1、 SW620和HCT-15癌細胞相比，正常腸上皮細胞HIEC-6中的GLUT12含量最低(相對表達值為1，P< 0.05)。 見圖1。

A

B

A B

注：A為核酸在凝膠中的條帶圖；B為GLUT12基因相對于HIEC-6表達值，與HIEC-6比較，*P<0.05

2.2 GLUT12蛋白在CRC中的表達 GLUT12在腫瘤組織和正常組織中均有不同程度的表達，GLUT12在腫瘤組織中的表達水平為(3.2±0.3)，正常組織的表達水平為(0.5±0.6),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 GLUT12在腫瘤及正常組織中的表達(免疫組化法，×400)

2.3 GLUT12蛋白在CRC細胞中的表達定位與水平的變化 在含有少量葡萄糖的培養基中GLUT12在細胞中僅有少量的表達，主要集中于細胞核周圍。隨著培養基中葡萄糖含量的升高，GLUT12含量升高，主要集中分布于細胞膜周圍。當DLD-1細胞與GLUT12抑制劑一起培養時，高糖條件并不能提高該蛋白在細胞中的表達，也不能改變其在細胞中的定位。見圖3。

免疫印跡法也發現，細胞在含低濃度葡萄糖的培養基培養時 (5 mM)，GLUT12的表達含量很低(97.3±6.8)%。升高培養基中的葡萄糖含量(20,100 mM)，該蛋白表達亦顯著性地升高，分別為(123.2±5.7)% 與(193.4±5.2)%，差異有統計學意義(P<0.05)。當細胞和GUT12抑制劑QC一起孵育時，即使升高培養液中的葡萄糖含量，GLUT12的表達水平也未出現顯著變化。見圖4。

2.3 GLUT12抑制劑對OXA殺傷腫瘤細胞的協同作用 MTT試驗顯示， DLD-1 細胞和QC一起孵育后，其活力和空白處理組相比并沒有顯著變化[Q:(94.7±4.3) %vs空白：(95.8±5.4)%]，差異無統計學意義(P>0.05)。OXA和細胞一起孵育能顯著地降低細胞活力[OXL:(89.4±4.2)%vs空白：(95.7±5.2)%，P< 0.05]。當OXA處理的DLD-1細胞培養液中聯合加入QC時，細胞的活力降至更低的水平[OXL+ Q:(63.3±7.1)%vsOXL:(89.7±4.2)%,P<0.05]。然而，對于SW620細胞來說，QC并不能產生類似的藥效協同作用。見圖5。

接下來的CFA實驗考察了癌細胞群落的數量和粒徑。QC單用并不會對癌細胞群落的數量產生明顯的影響[QC:(362.3±23.7)vs空白：(353.2±13.4),P>0.05]。OXA和細胞孵育并沒有明顯地減少細胞群落的數量[OXL:(347.6±17.2)vs空白：(352.7±13.4),P>0.05]。從形成的癌細胞群落的粒徑來說，QC單用亦不會對癌細胞群落的粒徑產生明顯地影響[QC:(716.8±15.2)vs空白：(591.7±33.4),P>0.05]。OXA和細胞孵育卻能明顯地減少細胞群落的粒徑 [OXL:(125.1±12.4)vs空白：(591.7±32.6),P< 0.05]。當QC和OXA聯用幾乎能殺死所有癌細胞群落。見圖6。

圖3 熒光顯微鏡下GLUT12蛋白在不同條件下的變化(×400)

注：A表示對照組；B表示5 mM葡萄糖處理組；C表示10 mM葡萄糖處理組；D表示10 mM葡萄糖+5 mM QC共同培養組

圖4 蛋白印跡法檢測不同條件下GLUT12的變化

注：A為GLUT12蛋白條帶圖；B為相應條帶的密度測定柱狀圖，與低糖組(5 mM)相比，*P<0.05

圖5 MTT法檢測QC與OXA的協同作用

注：Q為QC組(濃度為5 mM)；OXL+Q為QC與OXA聯用組與空白組相比，*P<0.05

圖6 腫瘤集落生成法檢測QC與OXA的協同作用(n=3)

注：A為不同藥物孵育條件下腫瘤細胞的集落生成情況，使用0.5%結晶紫溶液對細胞群落進行染色；B為相應的關于腫瘤集落大小比較，Q為QC組(濃度為5 mM)，OXL+Q為QC與OXA聯用組

3 討論

本研究證實GLUT12在CRC細胞和腫瘤組織中均有表達。體外功能驗證試驗也提示該蛋白在CRC的發展中起到一定的促進作用。細胞毒性實驗說明該蛋白有可能成為聯合用藥方面的治療性靶點。

RT-PCR實驗證實GLUT12基因在CRC細胞中異常升高，免疫組化的結果證實其蛋白在腫瘤組織中的表達和正常組織比也是升高。目前關于GLUT12在CRC中的報道較少，Pujolgimenez等[5]發現GLUT12基因在CRC細胞HT29中的表達是上調的。本研究選用更多類型的CRC細胞株作為研究對象。為了對比該研究也觀察了該基因在正常結腸上皮細胞HIEC-6中的表達水平，綜合Pujolgimenez等的實驗以及本實驗的結果，可以推測CRC腫瘤細胞需要較多的葡萄糖轉運體來維持對葡萄糖的營養需求[9-10]。Pujolgimenez等[5]發現GLUT12在乳腺癌與前列腺癌中的表達是異常升高，與本實驗的發現一致。

細胞免疫化學和免疫印跡實驗顯示，GLUT12蛋白在高糖環境下會上調表達濃度，表明GLUT12在體內腫瘤組織中有可能是通過提高自身表達水平來滿足營養需求。在靜息狀態下，GLUT12主要分布于細胞核周圍，當細胞培養基中加入胰島素時，GLUT12會轉運到細胞膜周圍，為轉運葡萄糖做好準備[11]。本實驗也發現了類似的現象，QC能阻斷高糖引起的該蛋白表達的上調和細胞內的轉運。本研究的發現與關于QC抑制葡萄糖轉運蛋白的報道一致[12]。

MTT及CFA細胞毒性試驗發現，QC與OXA合用會起到很好的協同作用，而在另一種CRC細胞株SW620上沒有觀察到類似的協同作用。鑒于DLD-1中的GLUT12含量比SW620高很多(見上述基因表達結果)，檢測QC和OXA協同作用取決于GLUT12的基礎表達含量的高低。另外，這種結果的差異也可能是由于這兩種細胞來源的不同造成，如DLD-1細胞來源于人結腸腺癌細胞，而SW620細胞則是來源于人結腸癌轉移灶[13]。

CRC細胞中有多種葡萄糖轉運體存在[9]，如GLUT1和GLUT4等，本研究雖然證實CRC細胞或組織中的GLUT12確有表達，卻未進一步考察這些葡萄糖轉運體相互協作的具體作用機制。此外本次研究也未深入分析GLUT12是否還參于到糖酵解等代謝通路或者P53等信號通路，如條件允許還可圍繞GLUT12開展更多機制性的研究。本文對GLUT12在CRC中表達和功能做了初步研究，在體外評價了GLUT12抑制劑QC和常用抗癌藥物OXA聯合應用的價值。這些發現為進一步驗證GLUT12作為CRC治療性靶點的可能提供了研究基礎。