安徽省某三甲醫院銅綠假單胞菌分布及耐藥特點研究

殷 俊 常 嘯 程 君 周仲松 蘇 菲 葉 英 李家斌

銅綠假單胞菌(P.Aeruginos,PA)是一類革蘭染色陰性的非發酵菌，在臨床分離的病原菌中較常見，并且有逐漸上升的趨勢。有報道[1]顯示，因PA感染所致的病死率高達51%。由于PA特殊的耐藥特點(細胞膜通透障礙)，以及對替加環素先天耐藥的特征，臨床治療相對困難，耐藥菌株較多，故而對PA進行耐藥監測，統計其流行病學特征及研究其地區耐藥基因的分布具有重要的意義。本研究收集安徽省某三甲醫院2015年8月至2017年9月臨床分離的PA野生株，進行了藥敏分析，并對其進行了一定的分子生物學實驗，以觀測PA的耐藥特點。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集安徽省某三甲醫院2015年8月至2017年9月臨床分離的1 857株PA野生株，均來源于臨床確診感染患者，并篩除重復菌株，鑒定按常規操作規程鑒定到位。

1.2 方法 采用自動化藥敏板進行藥物敏感實驗鑒定，獲得臨床分離株后，按照說明書要求調整菌懸液濃度，藥敏板在機外孵育，一次性上機讀取結果，由計算機進行分析處理，并報告藥敏結果。質控菌株為AATCC27853。應用自動化藥敏板對1 857株PA進行了藥敏檢驗，包括阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、慶大霉素及亞胺培南共9種抗菌藥物。藥敏實驗結果按CLSI 2016年標準進行判讀[2]，分為敏感、中介、耐藥3種結果，并用WHONET 5.3軟件進行數據分析。PCR法對耐碳青霉烯類抗菌藥物菌株進行耐藥基因的擴增，包括blaTEM、blaPER、blaVEB、blaOXA、金屬酶基因VIM、IMP、SIM、GIM及外膜蛋白OprD2基因。測序結果在GenBank上進行比對。

1.3 觀察指標 將所有菌株編號后,判讀其對不同抗菌藥物的最低抑菌濃度值,根據CLSI 2016標準進行耐藥、中介和敏感3種不同耐藥程度的劃分。耐藥基因的擴增結果測序后與GenBank進行比對，相似性>95%判定為同一基因。

2 結果

2.1 菌株的時間分布特點 1 857株PA株中，發現分離株最少的月份為2015年9月(43株)、2016年4月(43株)、2016年5月(42株)，最多的月份為2017年8月(118株)，2017年9月(113株)，2017年6月(98株)，多數月份分離菌株數在60～80株。見圖1。

圖1 2015年8月至2017年9月臨床分離PA時間分布

2.2 菌株的臨床科室分布特點 ICU和呼吸內科為PA分離最多的科室，其中該醫院3個不同ICU共分離489株(26.33%)，其中ICU 221株(11.90%)，神經內科ICU 164株(8.83%)，急診ICU 104株(5.60%)，呼吸科252株(13.57%)，其次為燒傷科127株(6.84%)。最后為神經內科116株(6.25%)，神經外科101株(5.44%)，泌尿外科92株(4.95%)，心外科67株(3.61%)，血液內科60株(3.23%)，內分泌科56株(3.02%)，康復科54株(2.91%)。

2.3 菌株來源分布 所有分離的菌株中，來源于痰液1 261株(67.91%)，尿液122株(6.57%)，分泌物115株(6.19%)，血液83株(4.47%)，手術切口74株(3.98%)，傷口分泌物54株(2.91%)，引流液31株(1.67%)，膽汁29株(1.6%)，支氣管肺泡灌洗液18株(0.97%)，胸腔積液11株(0.59%)，膿液10株(0.54%)，中心靜脈導管8株(0.43%)，氣管分泌物7株(0.38%)，腹水6株(0.3%)，外周導管5株(0.27%)，咽拭子5株(0.27%)，結締組織4株(0.22%)，胃液2株(0.11%)，關節液2株(0.11%)，上呼吸道2株(0.11%)，子宮分泌物2株(0.11%)，骨髓1株(0.05%)，腦脊液1株(0.05%)，透析液1株(0.05%)，其他3株(0.16%)。

2.4 PA的耐藥結果 PA碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南的耐藥率達到32.69%，高于其他抗菌藥物耐藥率。對妥布霉素、慶大霉素及左氧氟沙星的耐藥率較低，均小于18%。對阿米卡星的敏感率最高，達到78.08%。見表1。

表1 1 857株PA對不同抗菌藥物的耐藥結果[株(%)]

2.5 對碳青霉素類抗菌藥物耐藥的607株細菌耐藥基因擴增結果 檢出攜帶blaTEM34株，blaPER41株、blaVEB7株、blaOXA63株。檢出攜帶VIM基因121株，IMP基因125株，SPM基因65株，SIM基因0株，GIM基因0株。其中有98株攜帶兩種耐藥基因，無攜帶3種及以上產酶耐藥基因的菌株。測出孔蛋白基因缺失417株，占總數的68.7%。見圖2。

圖2金屬酶及外膜蛋白電泳圖

注：M為Marker；1為外膜蛋白丟失；2為SPM陽性；3為VIM陽性；4為IMP陽性

3 討論

PA是廣泛存在于社區及醫院的一類致病菌，以院內感染多見，且難以從醫院環境內清除，對如腫瘤、血液、ICU等病房的免疫力低下患者帶來巨大潛在威脅。碳青霉烯類藥物曾為治療PA感染的重要藥物，但隨著臨床的廣泛應用，PA對該類藥物的耐藥率也逐步上升，因此在臨床治療中存在極大的困難[3]。對院內PA臨床分離株進行研究，總結其空間、時間、標本來源分布太特征，監測其耐藥特點，并對耐藥機制進行分析，有助于對該院感染PA的患者及時采取相應措施，從而在第一時間選擇有效藥物。

該醫院26個月共分離出無重復菌株的1 857株PA，且隨時間推移，在數量上有逐步上升趨勢，2017年8、9月臨床分離的菌株數高于其他月份，與國內其他地區統計結論大致相仿[4]。提示今后PA可能會成為極常見的臨床分離株。PA作為條件致病菌，具有非常強的適應能力，是醫院感染中醫院獲得性肺炎以及呼吸機相關肺炎的主要病原菌[5-6]。在本研究中，絕大部分菌株來自住院患者。來自呼吸科的PA占13.6%，而痰標本占比則達到67.91%，這可能與住院患者機體免疫力下降，呼吸道屏障相對脆弱，呼吸道分泌物增加等因素有關。且有研究[7]指出，老年PA感染患者中，肺部感染發生率最高，與本研究統計結果一致。除痰液之外，尿液、各處分泌物及血液也是多見的標本來源。本研究中，ICU為分離出PA最多的科室，考慮與收住患者一般狀態相關，與其他研究結果大致相符[7-9]。

在本研究中，PA對于哌拉西林/他唑巴坦和亞胺培南的敏感率較低，都低于60%，故而在該醫院PA感染的治療中，不推薦以上2種抗菌藥物做為治療PA的首選藥物。阿米卡星對其敏感率較高，有78.08%的PA患者均對阿米卡星敏感，考慮到PA耐藥的復雜性，結合PA對于頭孢吡肟耐藥性較低(16.05%)，可以考慮頭孢吡肟聯合阿米卡星做為該地區治療PA的首選治療。碳青霉烯類藥物為抗革蘭陰性菌感染的常用藥物，但本研究中提示，PA對亞胺培南的敏感性低于60%，耐藥率卻高達32.69%，值得進一步完善相關檢測，在本地區其他醫院相關研究中，數據與本研究類似[10]。故在此基礎上，甄選出全部607株對亞胺培南耐藥的PA，進行了耐藥基因及外膜蛋白OprD2基因的檢測。

本研究中共檢出攜帶VIM基因121株，IMP基因125株，此兩種檢出率最高，共占耐亞胺培南的PA中40.53%，SPM基因65株，占10.71%，SIM基因0株，GIM基因0株。blaTEM34株、blaPER41株、blaVEB7株、blaOXA63株。其中有98株攜帶2種耐藥基因，無攜帶3種及以上產酶耐藥基因的菌株。測出孔蛋白基因缺失417株，占總數的68.70%。此數據亦表明PA的耐藥機制多樣且復雜，而其對亞胺培南的耐藥機制更存在多種因素的參與，其中外膜蛋白OprD2缺失率接近70%，充分說明了外膜蛋白缺失為PA對亞胺培南耐藥的主要機制。但根據目前國內其他地區報道[11]，該數據存在地區及人群差異。

PA目前為醫院感染的重要致病菌，預計近期臨床PA感染會進一步增多。PA感染部位以呼吸道最為多見，泌尿系、傷口創面及血液或成為繼呼吸道后的重要感染部位，故推測在該醫院，泌尿系及血液的PA感染需加強警惕。外膜蛋白缺失目前仍為該醫院耐亞胺培南的PA的主要耐藥機制。根據藥敏結果，可考慮頭孢吡肟聯合阿米卡星做為一線治療方案。