浮游植物樣品的前處理優化及計數方法研究

路曉鋒，林青*，韋雪檸，鄧雷，賀瑩，練海賢

（1.廣東粵港供水有限公司，廣東 深圳 518021；2.廣東粵海水務股份有限公司，廣東 深圳 518021）

1 引言

浮游植物是水質的重要指示參數，也是水生態和水環境評價的重要內容，浮游植物的群落結構會隨著水體環境的改變而快速改變[1]，因而可根據浮游植物的種類與數量的變化反映出水體環境的變化[2、3]。目前，浮游植物的計數方法主要包括人工計數和儀器分析，由于儀器分析技術尚不完全成熟，故而人工計數仍然是現階段浮游植物計數的主流方法。

浮游植物計數前需要進行前處理固定，這是浮游植物監測過程中重要的步驟，直接影響浮游植物計數的準確度和精密度。目前，浮游植物檢測的前處理方法包括自然沉淀法[4、5]、超聲振蕩法[6]、離心沉淀法[7]等。自然沉淀法主要包括正置顯微鏡自然沉淀法與倒置顯微鏡自然沉淀法，其中，正置顯微鏡自然沉淀法無需使用專門的設備儀器即可完成操作，但存在浮游植物固定時間長，虹吸過程存在誤差的缺點[8]；倒置顯微鏡自然沉淀法能在縮短浮游植物固定時間的同時，還能有效降低固定操作帶來的浮游植物生物量損失[9～12]。超聲振蕩法利用濾膜抽濾水樣使浮游植物富集于膜上，再利用超聲裝置收集濾膜上脫落的浮游植物，超聲振蕩法能快速實現浮游植物的前處理操作，但存在超聲過程中對浮游植物的破壞而影響計數結果。離心沉淀法利用離心作用使浮游植物快速沉降，然后通過收集沉淀部分作為待測液，離心沉淀法能快速實現浮游植物的沉降處理，但在樣品離心前的分批轉移以及沉降不完全容易造成浮游植物損失。

本研究對自然沉淀法、超聲振蕩法和離心沉淀法進行前處理時間優化，然后在優化條件下，分別使用正置顯微鏡法和倒置顯微鏡法應用于實際水樣浮游植物的檢測，考察對比了每種方法檢測出的浮游植物種屬、豐度及對應的精密度，通過綜合分析確定最優的浮游植物檢測方法。

2 材料與方法

2.1 主要儀器和試劑

儀器：正置顯微鏡Olympus BX53；倒置顯微鏡Nikon TS100F；沉降器、超聲波清洗機VGT-1024F、離心機80-1、真空泵GM-1.0A；計數框0.1mL（20mm×20mm）；蓋玻片（22mm×22mm）；量筒1L；虹吸管；洗耳球；移液管10mL；移液槍1mL；離心管50mL；容量瓶50mL；尼龍濾膜：直徑50mm、孔徑0.45μm。

試劑：魯哥氏液，40g碘溶于含碘化鉀60g的1000mL水溶液中；脫色液，10g硫代硫酸鈉溶于100mL水溶液中。

2.2 浮游植物固定與計數

2.2.1 正置顯微鏡自然沉淀法

（1）樣品采集：采水樣1L，取水體表層下0.5m處的水樣。

（2）樣品固定：水樣移至1L的量筒內，加入15mL的魯哥氏液固定，搖勻，避光室溫保存。

（3）沉淀濃縮：自然沉淀一定時間后，用虹吸管抽掉上清液，余下約30mL沉淀物轉入50mL容量瓶中，為減少樣本的損失，再用上清液少許沖洗量筒幾次，沖洗液加入到容量瓶中，最后定容。

（4）浮游植物計數：將濃縮定容后的樣品充分搖勻，使用0.1mL吸管吸出0.1mL的樣品注入計數框，蓋好蓋玻片使樣品分布均勻，在10×40倍顯微鏡下計數，所得結果按下式換算成每毫升水中浮游植物的數量：

式中：

N—每毫升水中浮游植物的數量，個/mL；

A—計數框面積，400mm2;

Ac—計數面積，視野面積×視野數；

Vw—1L水樣經沉淀濃縮后的樣品體積，50mL；

V—計數框體積，0.1mL；

n—計數所得浮游植物的個體數，個細胞。

2.2.2 倒置顯微鏡自然沉淀法

（1）樣品采集：用采水器采集原水裝入500mL體積的采樣瓶，立即添加魯哥氏液2.5mL。

（2）計數樣品制備步驟：1）將10mL水樣搖勻后注入沉降管中；2）蓋好蓋玻片靜置且不能有氣泡，靜置一定時間；3）加入濃度10%的硫代硫酸鈉0.5mL進行脫色；4）將沉淀好的水樣的上清液移入廢液框；5）蓋好底座蓋玻片，不能有氣泡；6）于倒置顯微鏡上鑒定和計數。

（3）浮游植物計數：于10×40倍顯微鏡下計數，所得結果按下式換算成每毫升水中浮游植物的數量：

式中：

N—原水藻豐度，個/mL；

V—沉降柱體積，mL；

D—載玻片直徑，mm；

d—計數鏡頭直徑，mm；

n—計數鏡頭數 ；

C—計數細胞數，個細胞。

2.2.3 超聲振蕩法

（1） 樣品采集：同2.2.1的（1）。

（2）計數樣品制備步驟：1）將1L水樣取出49mL，對剩余水樣經抽濾裝置進行過濾；2）將濾水后的濾膜取出，放入盛有49mL水樣的燒杯中，將其放入超聲波振蕩器振蕩；3）將振蕩后的濾膜除去，將濃縮后的水樣定容至50mL。

（3）浮游植物計數：方法同2.2.1的（4）。

2.2.4 離心沉淀法

（1）樣品采集：同2.2.1的（1）。

（2）計數樣品制備步驟：將樣品用50mL的離心管在3000r/min的轉速下采用分批離心的方法進行濃縮，每批次沉淀物約為2.5mL，合并所得的沉淀物用上清液定容至50mL，混勻后計數。

（3）浮游植物計數：方法同2.2.1的（4）

2.3 數據分析

取3個點位（1#、2#、3#）的源水在顯微鏡400倍放大下進行浮游植物觀測，每個源水點位重復測定2次，按浮游植物細胞數進行計數，根據浮游植物的形態特征進行鑒別分類計數[13、14]。

3 結果

3.1 正置顯微鏡自然沉淀法浮游植物固定時間優化

取1#、2#、3#不同點位的水樣1000mL，選取6、12、18、24、30h進行浮游植物固定時間優化，如圖1所示。結果表明，固定時間從6h增至18h，浮游植物豐度逐漸增加；當固定時間繼續增加至30h，浮游植物豐度基本達到平衡。因此，正置顯微鏡自然沉淀法浮游植物固定時間為18h。

圖1 正置顯微鏡自然沉淀法浮游植物固定時間優化結果

3.2 倒置顯微鏡自然沉淀法浮游植物固定時間優化

取1#、2#、3#不同點位的水樣10mL，選取1、2、3、4、5、6、7、8h進行浮游植物固定時間優化，如圖2所示。結果表明，固定時間從1h增至5h，浮游植物豐度不斷增加；當固定時間繼續增加至8h，浮游植物豐度基本達到平衡。因此，倒置顯微鏡自然沉淀法浮游植物固定時間為5h，在保證實驗準確度的同時，可以有效縮短固定時間，提高檢測效率。

圖2 倒置顯微鏡自然沉淀浮游植物固定時間優化結果

3.3 超聲振蕩法振蕩時間優化

取1#、2#、3#不同點位的水樣1000mL過濾后，在功率100W超聲功率下，選取5、10、15、20、25min進行超聲震蕩時間優化，如圖3所示。結果表明，當超聲震蕩時間小于15min時，隨著超聲震蕩時間的增加，從濾膜上脫落的浮游植物數量也會相應增加，所以檢測到的浮游植物豐度逐漸增加；當超聲震蕩時間大于15min時，檢測到浮游植物豐度基本達到平衡，這表明最優的超聲振蕩時間為15min。

圖3 超聲振蕩時間優化結果

3.4 離心沉淀法離心時間優化

取1#、2#、3#不同點位的水樣1000mL，在3000r/min的轉速下分批離心濃縮。選取5、10、15、20、25min進行離心時間優化，如圖4所示。結果表明，當離心時間小于15min時，隨著離心時間的增加，懸浮的浮游植物沉降到離心管底部的數量會相應增加，所以檢測到的浮游植物豐度逐漸增加；當離心時間大于15min時，檢測到浮游植物豐度基本達到平衡，這表明最優的離心時間為15min。

圖4 離心時間優化結果

3.5 應用研究

3.5.1 實際水樣的浮游植物種類和總數研究

在優化的條件下，將正置顯微鏡自然沉淀法、倒置顯微鏡自然沉淀法、超聲振蕩法和離心沉淀法應用于3種實際水樣（水樣A#、水樣B#和水樣C#）浮游植物的檢測，通過檢測到的浮游植物種類和數量來計算不同方法的準確度。4種方法的匯總對比結果見下表。從結果分析，倒置顯微鏡自然沉淀法觀測的浮游植物種類與總數均比其它3種方法要高，總體上超聲振蕩法僅次于倒置顯微鏡自然沉淀法的觀測效果，正置顯微鏡自然沉淀法次之，離心沉淀法觀測到的浮游植物數與種類較少。

3.5.2 浮游植物精密度分析

在優化的條件下，將正置顯微鏡自然沉淀法、倒置顯微鏡自然沉淀法、超聲振蕩法和離心沉淀法應用于3種實際水樣浮游植物的檢測，通過檢測6個平行樣本來考察不同方法的精密度。對比結果見圖5，結果表明，倒置顯微鏡自然沉淀法相比后3種方法取用的樣品水量較少，且數據具有較好的精密度，反映出倒置顯微鏡自然沉淀法檢測結果較為穩定，相對偏差小。因此，倒置顯微鏡自然沉淀法具有精密度好的優勢。

四種浮游植物方法不同點位檢測結果比較表（P＜0.05）

圖5 水樣A#、B#、C#不同前處理方法精密度分析圖

4 討論

由圖1～圖4浮游植物檢測的前處理時間優化結果可知，綜合考慮時間長度和結果準確性精密度，4種方法的前處理時間分別采用不同時間段處理后選用最優的時間作為優化后的固定時間，正置顯微鏡自然沉淀法固定時間為18h，倒置顯微鏡自然沉淀法固定時間為5h，超聲振蕩法振蕩時間為15min，離心沉淀法離心時間為15min。從前處理時間分析倒置顯微鏡自然沉淀法、超聲振蕩法、離心沉淀法均能較好地滿足浮游植物的快速檢測需求。

對4種前處理方法的優劣進行比較，自然沉淀法是利用浮游植物的自然沉降達到浮游植物富集的目的[15～17]，正置顯微鏡自然沉淀法需要耗時18h，過長的前處理時間會影響結果的準確性[18]。同時在虹吸的操作過程中輕微的振蕩會造成水體中部分浮游植物的懸浮，抽吸上清液時會把這部分浮游植物去除造成實驗數據平行性較差，導致實驗誤差[19、20]。

超聲振蕩法操作時間短，但存在較大的誤差，當水樣中的浮游植物或雜質較多濾膜難以清洗干凈時，可能造成浮游植物數量損失，同時對于群體浮游植物，如平裂藻、柵藻、微囊藻、假魚腥藻、魚腥藻等，在超聲過程中會被打散成單個細胞，造成浮游植物數量的不穩定。而且過大的超聲功率作用下，部分浮游植物細胞可能會破裂碎片化[6]，影響計數結果。

離心沉淀法能快速縮短浮游植物沉降時間，但在分批轉移離心樣品時容易造成浮游植物的損失，同時密度較小的浮游植物在轉移過程和離心后容易上浮，導致浮游植物平行計數結果不穩定。

相比正置顯微鏡自然沉淀法，采用倒置顯微鏡自然沉淀法不僅可以把固定時間縮短為5h，而且避免了虹吸操作造成的浮游植物損失，直接一步沉淀到位，可省略正置顯微鏡自然沉淀法中的中間操作環節。相比超聲振蕩法和離心沉淀法，雖然倒置顯微鏡自然沉淀法前處理時間比超聲振蕩法和離心沉淀法要長，但其計數的準確性和精密度均比超聲振蕩法和離心沉淀法要好。

倒置顯微鏡自然沉淀法采用的沉淀板計數框體積約為3mL，比正置顯微鏡自然沉淀法、超聲振蕩法和離心沉淀法的計數框體積要大0.1mL，能使分類計數和鑒定的結果更為全面，這與上表的結果是一致的。此外，倒置顯微鏡自然沉淀法操作過程較簡便，無需通過多次沖刷轉移固定后的水樣，只需通過沉淀杯將水樣一步沉降到位，可有效提高準確度。

由圖5對4種方法的精密度比較可知，總體上倒置顯微鏡自然沉淀法相比于正置顯微鏡自然沉淀法、超聲振蕩法、離心沉淀法具有檢測用的水量少且精密度較好的優勢，分別對不同點位的平行檢測結果顯示，倒置顯微鏡自然沉淀法檢測數據具有較高穩定性。

綜上分析，倒置顯微鏡自然沉淀法比正置顯微鏡自然沉淀法具有操作耗時短、操作簡便的優勢，比超聲振蕩法和離心沉淀法的準確性和精密度均較好。因此，固定時間5h的倒置顯微鏡自然沉淀法滿足浮游植物精準檢測分析要求。