莪術(shù)莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)

吳怡 顧雅坤 符麗 曾琳

摘 要 為莪術(shù)種質(zhì)資源穩(wěn)定保存提供一條新途徑。 以莪術(shù)組培苗莖尖為試材，用玻璃化法進(jìn)行超低溫保存后， 于25℃用0.1% TTC溶液培養(yǎng)24 h后檢測(cè)生活力。結(jié)果表明，切取2～3 mm長(zhǎng)、繼代培養(yǎng)60 d的莪術(shù)組培苗莖尖，避光條件下，用含0.3 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)7 d，室溫下，莖尖用60%的PVS2裝載液裝載10 min，0℃用100%的PVS2玻璃化保護(hù)液對(duì)莖尖脫水處理30 min，快速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存16 h；取出莖尖于40℃水浴中解凍2 min，室溫下用US溶液洗滌20 min，立即用0.1% TTC溶液于25℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，莪術(shù)莖尖的生活力最高可達(dá)100%。表明該方法可用于莪術(shù)種質(zhì)資源的保存。

關(guān)鍵詞 莪術(shù) ；莖尖 ；種質(zhì)資源 ；玻璃化法 ；超低溫保存

中圖分類號(hào) S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.010

Abstract Shoot tips of tissue cultured Curcuma zedoaria were subcultured， vitrified and cryopreserved to get a new approach for stable conservation of C. zedoaria. The test-tube plantlets of C. zedoaria were subcultured for 60 d， and their shoot tips were cut 2～3 mm long and cultured in the MS solid medium supplemented with 0.3 mol/L sucrose for 7 days in the dark. Then the shoot tips were loaded with 60% PVS2 for 10 min at 25℃， dehydrated for 30 min at 0℃ with 100% PVS2 as vitrification protection solution and placed immediately into liquid nitrogen for cryopreservation for 16 h. The cryopreserved shoot tips were thawed in aqueous bath for 2 min at 40℃， and rinsed with US solution for 20 min at the room temperature. The survival rate of the shoot tips was measured by using 0.1% TTC solution and the highest survival rate was up to 100.00%. This indicates that the vitrified cryopreservation may be used for preservation of germplasm resources of C. zedoaria.

Keywords Curcuma zedoaria ； shoot-tips； germplasm resources ； vitrification ； cryopreservation

莪術(shù)[Curcumazedoaria （Christm.） Rosc.]是姜科（Zingiberaceae）姜黃屬（Curcuma）多年生草本植物[1]。根莖為中藥莪術(shù)，有消食、行氣解郁、止痛破淤及治療婦女血淤閉經(jīng)等功效，其所含姜黃素和揮發(fā)油還具抗氧化和抗腫瘤等作用[2]，姜黃素已被美國(guó)國(guó)立腫瘤所（NCI）列為第三代癌癥化學(xué)預(yù)防藥物[3]；而莪術(shù)中揮發(fā)油主要成分萜類化合物可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或者凋亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等[4]。由此可見(jiàn)，莪術(shù)的開(kāi)發(fā)前景非常可觀。目前莪術(shù)種質(zhì)資源的保存方法主要為傳統(tǒng)田間種植保存和組織培養(yǎng)保存。但傳統(tǒng)田間種植保存需要占用大面積種植地[5]，易受自然災(zāi)害、病蟲(chóng)害影響，耗費(fèi)大，且長(zhǎng)期種植將引起種質(zhì)資源退化、變異，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源丟失等；組織培養(yǎng)則需頻繁進(jìn)行繼代培養(yǎng)，易造成樣品污染、試管苗變異等[5]。因此，探索一種適用于莪術(shù)種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的新途徑具有十分重要的意義。

超低溫保存是指在-196℃液氮中保存生物材料的方法[6]。早在1897年，就有人嘗試用-192℃的液態(tài)空氣作為冷凍介質(zhì)保存植物種子，后來(lái)由于液氮具有價(jià)格便宜、容易制得且性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)而成為常用的超低溫保存冷凍介質(zhì)。超低溫保存具有設(shè)備簡(jiǎn)單、容易操作、穩(wěn)定性好及一次處理可以長(zhǎng)期保存等諸多優(yōu)點(diǎn)，在保存植物種質(zhì)資源方面，有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[5]。目前，已有用液氮保存植物繁殖器官、營(yíng)養(yǎng)器官、組織培養(yǎng)物、頑拗性或中間型種子等的先例[6]。在藥用植物、果樹(shù)以及園藝作物等方面也有諸多研究，如白木香[7]、益智[8-9]、高良姜[10]、降香黃檀、決明[11]、菊芋[12]；蘋(píng)果、梨[13]、大蒜[14]、生姜[15]、土豆[16]等。不同植物，其取材、保存、前期處理等各不一樣，但尚未見(jiàn)莪術(shù)種質(zhì)資源玻璃化超低溫保存的相關(guān)研究。本試驗(yàn)以莪術(shù)莖尖為材料，通過(guò)系統(tǒng)的超低溫保存研究，擬建立一套適用于莪術(shù)種質(zhì)資源的保存技術(shù)體系，為莪術(shù)種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定保存提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

切取溫州莪術(shù)[Curcuma zedoaria （Christm.） Rosc.]（由國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供）地下莖塊的幼芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，選取無(wú)污染、生長(zhǎng)狀況良好的試管苗，取莖尖作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 繼代培養(yǎng)

將莪術(shù)試管苗置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含3.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤、1.0 mg/L吲哚乙酸、30 g/L蔗糖、1.0 g/L活性炭、6.5 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基）中分別繼代培養(yǎng)15、30、45、60 d。

1.2.2 預(yù)培養(yǎng)處理

切取長(zhǎng)2～3 mm莪術(shù)試管苗莖尖，避光的環(huán)境下用含0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基分別預(yù)培養(yǎng)0、1、3、5、7 d。

1.2.3 裝載液處理

用LS（含2 mol/L甘油、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液）或60% PVS2（含0.15 mol/L蔗糖的MS溶液與100% PVS2按體積比40∶60混合）于25℃分別裝載處理0、5、10、15、20、25、30 min。

1.2.4 玻璃化保護(hù)液處理

用100% PVS2（含30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基亞砜、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液），在0℃條件下，分別處理莪術(shù)莖尖15、30、45、60、90 min。

1.2.5 液氮冷凍

將經(jīng)玻璃化保護(hù)液處理過(guò)的莪術(shù)莖尖迅速投入液氮中冷凍16 h。

1.2.6 水浴解凍及洗滌

取出莪術(shù)莖尖，在40℃水浴中分別解凍1、2、3、5、10 min；于25℃用US溶液（含1.2 mol/L蔗糖的MS溶液）洗滌20 min。

1.2.7 生活力檢測(cè)

放入0.1% TTC溶液中，于人工氣候培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)24 h，洗凈后用體視顯微鏡觀察莖尖染色情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)均為單因子試驗(yàn)，每處理15個(gè)帶芽莖尖，3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan法和LSD法進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 莪術(shù)莖尖生活力檢測(cè)

由圖1所示，A、B為未進(jìn)行玻璃化超低溫保存（對(duì)照組）莪術(shù)莖尖，C、D為玻璃化超低溫保存后的莪術(shù)莖尖。TTC作為氧化性的氫受體，可被活種子呼吸作用產(chǎn)生的脫氫輔酶還原成紅色的物質(zhì)，即有活性的莖尖會(huì)被染成紅色。因此，莖尖染色情況可反映莖尖生活力。

2.2 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

繼代培養(yǎng)能使組織細(xì)胞處于相同的生長(zhǎng)階段，減少試驗(yàn)材料個(gè)體差異帶來(lái)的誤差[15]。由圖2可知，繼代培養(yǎng)60 d，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力最高；繼代培養(yǎng)45、30 d，二者間超低溫保存生活力差異不顯著；繼代培養(yǎng)15 d，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力顯著低于其他各處理。

2.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基蔗糖濃度及裝載液對(duì)莪術(shù)莖尖超低溫保存的影響

預(yù)培養(yǎng)能使莪術(shù)莖尖組織中自由水含量降低，以適應(yīng)超低溫保存的脫水處理，增加細(xì)胞膜通透性，使冰凍保護(hù)劑快速滲透到細(xì)胞內(nèi)。由表1可知，未進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力為0，可能是由于莖尖中細(xì)胞含水量太高，超低溫保存形成大量冰晶造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致沒(méi)有生活力。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度相同時(shí)，超低溫保存后生活力隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，這可能是由于預(yù)培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞內(nèi)含水量相應(yīng)減少，超低溫保存時(shí)形成冰晶越少，細(xì)胞損傷越小，生活力越高。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1 d，超低溫保存后生活力隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加先增加后減少。而預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3、5、7 d時(shí)，超低溫保存后生活力隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加逐漸減少。說(shuō)明預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中蔗糖濃度過(guò)高，會(huì)使莖尖組織失水過(guò)多，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，原生質(zhì)體過(guò)度收縮，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡，從而使超低溫保存后生活力反而下降。綜合考慮，莪術(shù)莖尖在蔗糖濃度0.3 mo/ L的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7 d后，用60% PVS2進(jìn)行裝載處理，超低溫保存后生活力最佳。

2.4 裝載液處理時(shí)間對(duì)莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖3可知，隨著裝載液（60%PVS2）處理時(shí)間的增加，莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力先增加后減少。可能是由于裝載液處理莪術(shù)莖尖，使細(xì)胞內(nèi)水分減少，增加細(xì)胞滲透性。當(dāng)預(yù)處理時(shí)間不夠時(shí)，細(xì)胞內(nèi)含水量高，在超低溫保存過(guò)程中結(jié)冰，不利于莪術(shù)莖尖存活；而預(yù)處理時(shí)間太長(zhǎng)，細(xì)胞過(guò)度脫水，超低溫保存前莪術(shù)莖尖就受到了損傷，生活力下降。因此，裝載液處理的最佳時(shí)間為10 min。

2.5 玻璃化保護(hù)液處理時(shí)間對(duì)莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖4可知，隨著玻璃化保護(hù)液（100% PVS2）處理時(shí)間的延長(zhǎng)，莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)玻璃化保護(hù)液處理30 min時(shí)，生活力最高；處理15 min，細(xì)胞脫水效果較差，細(xì)胞內(nèi)含水量較高，超低溫保存后生活力低；超過(guò)30 min，細(xì)胞脫水過(guò)度，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高造成損傷，且隨著處理時(shí)間增加，冰凍保護(hù)劑乙二醇和二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞毒害作用越明顯，導(dǎo)致超低溫保存后生活力下降。可見(jiàn)，玻璃化保護(hù)液對(duì)莪術(shù)莖尖的最佳處理時(shí)間為30 min。

2.6 40℃水浴解凍時(shí)間對(duì)莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖5可知，隨著水浴解凍（40℃）時(shí)間的延長(zhǎng)，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力先增加后減少，其中解凍時(shí)間為2 min時(shí)，生活力最高。可能是由于此時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶完全融化，細(xì)胞內(nèi)和玻璃化保護(hù)液溫度已升至結(jié)冰溫度以上，不會(huì)產(chǎn)生二次結(jié)冰的現(xiàn)象或者形成較少冰晶，對(duì)莪術(shù)莖尖傷害最小。而解凍時(shí)間較短時(shí)，玻璃化保護(hù)液溫度仍很低，又或細(xì)胞內(nèi)冰未完全融化，細(xì)胞內(nèi)有可能二次結(jié)冰形成冰晶，細(xì)胞受到機(jī)械損傷，導(dǎo)致莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力低。而隨著解凍時(shí)間的增加，細(xì)胞完全解凍，可防止莪術(shù)莖尖在解凍過(guò)程中因再次結(jié)冰凍傷，但莖尖在玻璃化保護(hù)液中暴露的時(shí)間也相應(yīng)增加，冰凍保護(hù)劑對(duì)莪術(shù)莖尖細(xì)胞的毒害作用越明顯，生活力又隨之降低。

3 討論

玻璃化超低溫保存法能長(zhǎng)時(shí)間保存種質(zhì)資源，且組織材料的生長(zhǎng)狀況、脫水程度、迅速冷凍、解凍與超低溫保存后存活率密切相關(guān)。繼代培養(yǎng)能使細(xì)胞分裂分化程度保持一致，提高保存的存活率[15]。脫水程度與組織材料預(yù)培養(yǎng)、裝載液和冰凍保護(hù)劑處理時(shí)間等因素有關(guān)。水浴解凍能使超低溫保存材料連同冰凍保護(hù)劑快速越過(guò)晶核形成溫度而不形成冰晶或者較少形成冰晶，避免冰晶形成對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的機(jī)械損傷[17]。

Siliva等[18]對(duì)巴西植物Byrsonima莖尖進(jìn)行15 d繼代培養(yǎng)，玻璃化超低溫保存后再生率最高達(dá)90%。王貞等[19]用繼代培養(yǎng)了30 d的圓瓣扶芳藤莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存，恢復(fù)培養(yǎng)后成活率為75%。趙艷華等[20]用繼代培養(yǎng)了70 d的蘋(píng)果莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存，解凍后材料的存活率可穩(wěn)定在60%。用繼代培養(yǎng)了120 d的李試管苗莖尖進(jìn)行超低溫保存后，存活率在60%以上[21]。本試驗(yàn)用繼代培養(yǎng)60 d的莪術(shù)組培苗莖尖進(jìn)行玻璃化法超低溫保存，其生活力最高。

培養(yǎng)基中蔗糖濃度高能降低試驗(yàn)材料組織細(xì)胞的含水量，減少超低溫保存結(jié)冰對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器的損傷。Helianthus tuberosus L.莖尖在進(jìn)行超低溫保存前，用含0.4 mol/L蔗糖的液體MS培養(yǎng)基對(duì)莖尖進(jìn)行3 d預(yù)培養(yǎng)，品種“Shudi”菊芋莖尖存活率和再生率分別高達(dá)93%、83%[12]；用含0.3 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基對(duì)百合莖尖預(yù)培養(yǎng)1 d，成活率為87.5%[22]；用含0.7 mol/L蔗糖的培養(yǎng)基對(duì)李的離體莖尖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1 d，存活率達(dá)60%以上[21]；用含0.3、0.5、0.7和1.0 mol/L蔗糖的培養(yǎng)基對(duì)高山紅景天莖尖預(yù)培養(yǎng)1 d，超低溫保存成活率均接近100%[23]。本試驗(yàn)用含0.3 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基對(duì)莪術(shù)莖尖避光預(yù)培養(yǎng)7 d，再進(jìn)行玻璃化超低溫保存，生活力最高。

用裝載液和玻璃化保護(hù)液處理試驗(yàn)材料，可使莖尖進(jìn)一步脫水，有效防止凍害。室溫下用60% PVS1處理懷山藥（Dioscorea opposita Thunb.）帶芽莖尖60 min， 0℃用100% PVS1脫水處理60 min，超低溫保存后成活率為77.14%[24]；25 ℃用LS處理三角葉薯蕷莖尖20 min，0 ℃用100% PVS2脫水90 min，超低溫保存后存活率為83%[25]；用100% PVS2對(duì)葡萄莖尖脫水處理30 min，超低溫保存后再生率為57%[26]。本試驗(yàn)中，25℃用60% PVS2預(yù)處理10 min，0℃用100% PVS2溶液脫水處理30 min，玻璃化超低溫保存的生活力最高。其中，裝載液（60% PVS2）和玻璃化處理液（100%PVS2）均含有冰凍保護(hù)劑乙二醇和二甲亞砜，在冷凍時(shí)形成玻璃態(tài)，可減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，防止在冷凍過(guò)程中細(xì)胞器、細(xì)胞膜以及細(xì)胞壁凍壞，提高超低溫保存生活力。

解凍方法、解凍時(shí)間是影響試驗(yàn)材料超低溫保存存活率的另一重要因素。生姜玻璃化超低溫保存后，用37～40℃水浴解凍2 min的成活率為57.7%[15]；用38～40℃水浴解凍超低溫保存后秦艽休眠芽的成活率接近100%[27]；王艾平等[28]用25、40、45℃ 3種溫度解凍超低溫保存的紅芽芋莖尖，其中40℃水浴解凍3 min成活率最高，約為80%。李娟[29]對(duì)日本小果樹(shù)HASKAOP莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存研究發(fā)現(xiàn)，40℃水浴解凍60 s，成活率可高達(dá)66.67%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將玻璃化法超低溫保存后的莪術(shù)莖尖用40℃水浴解凍2 min，生活力最佳。

總之，對(duì)莪術(shù)莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存是可行的。但該保存法對(duì)莪術(shù)的遺傳穩(wěn)定性、藥用成分的表達(dá)是否有影響等，還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì). 中國(guó)植物志 （第16卷）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1981.

[2] 王 琰，王慕鄒. 姜黃屬常用中藥的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36（2）：80-84.

[3] 王 穎. 中藥郁金姜黃莪術(shù)的化學(xué)成分比較研究[D]. 重慶：重慶大學(xué)，2014.

[4] Lu J J， Dang Y Y， Huang M， et al. Anti-cancer properties of terpenoids isolated from RhizomaCurcumae--a review[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2012， 43（2）：406-411.

[5] 吳黎明，曾繼吾，彭抒昂，等. 香蕉莖尖的玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006，33（3）：501-506.

[6] 文 彬. 植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J]. 植物分類與資源學(xué)報(bào)，2011，33（3）：311-329.

[7] 劉軍民，徐梓勤，徐鴻華，等. 白木香種子的超低溫保存研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24（5）：414-415.

[8] 曾 琳，何明軍，陳 葵，等. 益智種子超低溫長(zhǎng)期保存方法探究[C]//中國(guó)作物學(xué)會(huì). 中國(guó)作物學(xué)會(huì)作物種子專業(yè)委員會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)會(huì)議論文集. 北京：中國(guó)作物學(xué)會(huì)作物種子專業(yè)委員會(huì)，2015.

[9] 曾 琳，吳 怡，何明軍，等. 超低溫冷凍對(duì)益智種子生理生化特性的影響[J/OL].廣西植物，2017[2017-06-13]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.

1134.Q.20170613.1758.002.html.

[10] 曾 琳，何明軍，陳 葵，等. 高良姜種子超低溫保存研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（28）：164-168.

[11] 曾 琳，何明軍，顧雅坤，等. 五種豆科藥用植物種子超低溫保存技術(shù)研究[J]. 氨基酸和生物資源，2017，39（1）：42-47.

[12] Zhang J M， Han L， Lu X X， et al. Cryopreservation of Jerusalem artichoke cultivars using an improved droplet-vitrificationmethod[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2017， 128（3）： 1-11.

[13] Niino T， Sakai A， Yakuwa H， et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of apple and pear by vitrification[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 1992， 28（3）： 261-266.

[14] 王艷軍，李錫香，向長(zhǎng)萍，等. 大蒜莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2005，32（3）：507-509.

[15] 杜來(lái)順，馮建軍，李曉華，等. 生姜玻璃化法超低溫保存技術(shù)[J]. 北方園藝，2014 （13）：123-125.

[16] Chen Q. Study on Cryopreservation Technology of Potato Stem Tip by Vitrification[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences， 2014 （8）： 12-17.

[17] 王君暉，黃純農(nóng). 玻璃化法-園藝作物莖尖和分生組織超低溫保存的新途徑-文獻(xiàn)綜述[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1994 （3）：277-282.

[18] Silva L C， Paiva R， Swennen R， et al. Shoot-tip cryopreservation by droplet vitrification of Byrsonimaintermedia A. Juss.： a woody tropical and medicinal plant species from Brazilian cerrado[J]. Cryo Letters， 2013， 34（4）： 338-348.

[19] 王 貞，高健洲，劉 燕. 扶芳藤莖尖的玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2007，43（2）：303-304.

[20] 趙艷華，周錫明，吳永杰. 蘋(píng)果離體莖尖超低溫保存方法的比較[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2003，30（6）：719-721.

[21] 趙艷華，吳雅琴，程和禾，等. 李離體莖尖的超低溫保存[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35（3）：423-426.

[22] Yi J Y， Gian L， Jongwook C， et al. Efficient cryopreservation of Lilium spp. shoot tips using droplet-vitrification[J]. Plant Breeding & Biotechnology， 2013： 131-136.

[23] 劉劍鋒，閻秀峰，程云清，等. 高山紅景天（Rhodiolasachalinensis A.Bor）莖尖包埋-玻璃化法超低溫保存與植株再生[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，33（3）：265-270.

[24] 李明軍，洪森榮，徐 鑫，等. 懷山藥種質(zhì)資源的玻璃化法超低溫保存[J]. 作物學(xué)報(bào)，2006，32（2）：288-292.

[25] Mandal B B， Dixit-Sharma S. Cryopreservation of in vitro shoot tips of Dioscoreadeltoidea Wall.， an endangered medicinal plant： effect of cryogenic procedure and storage duration[J]. Cryo Letters， 2007， 28（6）： 460-470.

[26] Ganino T， Silvanini A， Beghé D， et al. Anatomy and osmotic potential of the Vitis rootstock shoot tips recalcitrant to cryopreservation[J]. Biologia Plantarum， 2012， 56（1）： 78-82.

[27] 張延紅. 秦艽和黨參的休眠芽培養(yǎng)與玻璃化超低溫保存研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[28] 王艾平，尹明華，洪森榮，等. 紅芽芋莖尖的包埋玻璃化法超低溫保存[J]. 植物分類與資源學(xué)報(bào)，2015，37（6）：801-812.

[29] 李 娟. 日本小果樹(shù)HASKAOP離體莖尖玻璃化法超低溫保存的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.