TurboFlow在線凈化—液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽肉中20 種（氟）喹諾酮類獸藥殘留量

王炳玲 田霽昕 項(xiàng)佳林 艾連峰

摘 要：建立TurboFlow在線凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定畜禽肉中20 種（氟）喹諾酮類藥物（（Fluoro）quinolones，（F）QNs）殘留量的分析方法。樣品用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）進(jìn)行均質(zhì)提取，Cyclone-p在線凈化柱凈化富集提取液中的（F）QNs，然后將富集所得分析物洗脫，轉(zhuǎn)至Hypersil Gold C8分析柱，經(jīng)色譜分離后，用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明：西諾沙星、伊諾沙星和丹諾沙星在0.2～20.0 ng/mL的線性范圍內(nèi)線性良好，其余17 種（F）QNs在0.1～10.0 ng/mL的線性范圍內(nèi)線性良好，且R2均大于0.99；西諾沙星、伊諾沙星和丹諾沙星的定量限為

2 ?g/kg，其余17 種（F）QNs為1 ?g/kg；20 種（F）QNs在3 個(gè)水平的添加回收率為85.4%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.04%～8.57%。方法簡(jiǎn)單、快速、回收率高、重復(fù)性好，適用于動(dòng)物源食品中（F）QNs的定量及確證檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：TurboFlow在線凈化液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜；（氟）喹諾酮類藥物；殘留；畜禽肉

Determination of 20 （Fluoro） Quinolones Residues in Livestock and Poultry Meat by TurboFlow Online

Cleanup-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Bingling1， TIAN Jixin2， XIANG Jialin1， AI Lianfeng1，*

（1.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shijiazhuang 050051， China；

2.College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract： A new method was developed for the determination of （fluoro）quinolones （（F）QNs） residues in livestock and poultry meat using TurboFlow online cleanup （TFC）-liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Samples were extracted with methanol-acetonitrile （1 ： 1， V/V） mixture. Then the extract was purified on a Cyclone-p column. Subsequently， the analytes were separated on a Hypersil Gold C8 column before being analyzed by tandem mass spectrometry. The calibration curves showed good linearity with R2 > 0.99 in the concentration range from 0.2 to

20.0 ng/mL for cinoxacin， enrofloxacin and danofloxacin， and in the range from 0.1 to 10.0 ng/mL for 17 other （F）QNs. The limit of quantization for enrofloxacin， danofloxacin and cinoxacin was 2 μg/kg， while that for 17 other （F）QNs was 1 μg/kg. Average recoveries of the analytes fortified at three levels ranged from 85.4% to 108.2%， with relative standard deviations （RSDs） between 4.04% and 8.57%. The method was characterized by simplicity， rapidity， high recovery and good repeatability and was suitable for quantitative analysis and confirmation of （F）QNs residues in foods of animal origin.

Keywords： TurboFlow online cleanup-liquid chromatography； tandem mass spectrometry； （fluoro） quinolones； residue； livestock and poultry meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）05-0030-09

引文格式：

王炳玲， 田霽昕， 項(xiàng)佳林， 等. TurboFlow在線凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽肉中20 種（氟）喹諾酮類獸藥殘留量[J]. 肉類研究， 2018， 32（5）： 30-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http：//www.rlyj.pub

WANG Bingling， TIAN Jixin， XIANG Jialin， et al. Determination of 20 （fluoro） quinolones residues in livestock and poultry meat by turboflow online cleanup-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2018， 32（5）： 30-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http：//www.rlyj.pub

（氟）喹諾酮類藥物（（Fluoro）quinolones，（F）QNs）

是人工合成的含有4-喹酮母核的一類廣譜抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣、高效、吸收好、組織濃度高、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為獸醫(yī)臨床和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一[1]。（F）QNs在食用動(dòng)物飼養(yǎng)中的廣泛應(yīng)用必然導(dǎo)致其在食用組織中的殘留問題，而殘留的（F）QNs容易誘導(dǎo)人類的病原微生物對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[2]，

因此，（F）QNs的殘留問題已引起廣泛關(guān)注。美國(guó)禁止在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用（F）QNs；世界衛(wèi)生組織、歐盟及日本等國(guó)家和組織都將（F）QNs列入限制使用的獸藥名單中，并規(guī)定了相應(yīng)的最高殘留限量；我國(guó)于2002年規(guī)定環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、丹諾沙星（danofloxacin，DAN）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、惡喹酸（oxolinic acid，OXOA）及氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LU）7 種（F）QNs在動(dòng)物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500 μg/kg[3-7]。

目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)日臻完善，高選擇性、高靈敏度以及高通量等特性使其特別適合用于殘留分析，現(xiàn)已成為獸藥殘留分析的首選檢測(cè)方法之一，在（F）QNs殘留分析中的應(yīng)用較多[8-14]，應(yīng)用領(lǐng)域也非常廣泛，檢測(cè)的樣品包括環(huán)境中的水、土壤、食品中的蜂蜜、肉、蛋、乳等。但LC-MS/MS的前處理過程復(fù)雜繁瑣，所需工作量較大，且成本較高。多數(shù)樣品的前處理方法都需要經(jīng)過SPE小柱的手動(dòng)凈化富集[15-18]或是引入QuEChERS技術(shù)[19-20]才能達(dá)到殘留檢測(cè)的要求，動(dòng)物源食品的測(cè)定甚至還需要在固相萃取前加上脫脂這一步驟[21-23]。提取凈化步驟的增加不僅使檢測(cè)方法更加繁雜、分析效率降低，而且分析步驟越多，不同結(jié)構(gòu)類型的多種分析物同時(shí)達(dá)到符合殘留分析規(guī)定要求的技術(shù)指標(biāo)難度越大，準(zhǔn)確度很難保證。

TurboFlow在線凈化技術(shù)以多孔大粒徑的填料為吸附劑，不同類型的凈化柱鍵合不同的化學(xué)基團(tuán)，這種在線凈化柱結(jié)合了擴(kuò)散作用、體積排阻作用和化學(xué)作用，通過改變流動(dòng)相配比和選擇不同功能的色譜柱，大分子雜質(zhì)先被洗脫出凈化柱，而有機(jī)小分子藥物被吸附富集，快速實(shí)現(xiàn)在線凈化和分析檢測(cè)。該技術(shù)已成功應(yīng)用于食品中化學(xué)污染物的分析檢測(cè)，例如，其在動(dòng)物源食品中金剛烷胺的殘留檢測(cè)以及藥物中真菌毒素的快速測(cè)定等方面均有很好的應(yīng)用[24-27]。本研究運(yùn)用TurboFlow在線凈化-LC-MS/MS技術(shù)結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)方法[28-30]測(cè)定畜禽肉中20 種（F）QNs的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：吡哌酸（pipemidic acid，PIPA，純度99.0%）、伊諾沙星（enoxacin，ENO，純度99.0%）、麻寶沙星（marbofloxacin，MAR，純度99.0%）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR，純度99.0%）、氟羅沙星（fleroxacin，F(xiàn)LE，純度98.0%）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL，純度99.0%）、CIP（純度94.0%）、培氟沙星（pefloxacin，PEF，純度99.0%）、鹽酸洛美沙星（lomefloxacin hydrochloride，LOM，純度99.0%）、DAN（純度94.0%）、ENR（純度99.0%）、奧比沙星（orbifloxacin，ORB，純度99.0%）、西諾沙星（cinoxacin，CIN，純度99.5%）、加替沙星（gatifloxacin，GAT，純度98.0%）、SAR（純度97.0%）、司帕沙星（spatfloxacin，SPA，純度99.0%）、OXOA（純度98.3%）、DIF（純度96.0%）、萘定酸（nalidixic acid，NALA，純度99.5%）和FLU（純度98.3%），均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

內(nèi)標(biāo)化合物：氘代諾氟沙星（norfloxacin-D5，NOR-D5，純度99.4%）、氘代環(huán)丙沙星（ciprofloxacin-D8，CIP-D8，純度99.5%）和氘代恩諾沙星（enrofloxacin-D5，ENR-D5，純度99.0%）均購(gòu)于德國(guó)Witega公司。

甲酸、異丙醇、乙腈、丙酮和甲醇均為色譜純，水為Milli-Q高純水。

豬肉及雞肉樣品均購(gòu)自本地超市。

1.2 儀器與設(shè)備

TurboFlow在線凈化TSQ Quantum Ultra LC-MS/MS儀（由CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器（配備100 ?L定量環(huán)）、2 個(gè)耐壓1.25×105 kPa的四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀組成） 美國(guó)ThermoFisher公司；3K-15離心機(jī)

德國(guó)Sigma公司；PT2100均質(zhì)器 瑞士Kinematica

公司；Milli-Q純化系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取約5.00 g樣品，置于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)混合液（1 ?g/mL，125 ?L）和25 mL甲醇-乙腈溶液（1∶1，V/V），均質(zhì)1 min，4 000 r/min條件下離心10 min；取1 mL左右上清液，于45 ℃條件下氮吹至干，用1 mL 0.5%甲酸水溶液溶解，溶解液經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.2 在線凈化色譜條件

在線凈化程序主要為凈化和分離過程，凈化過程（TurboFlow chromatography，TFC）由上樣泵驅(qū)動(dòng)凈化流動(dòng)相在TurboFlow柱上完成，分離過程（LC）由分離泵驅(qū)動(dòng)分析流動(dòng)相在分析柱上完成。整個(gè)程序通過2 個(gè)六通閥的切換使流路改變，實(shí)現(xiàn)在線凈化富集。

凈化柱為Cyclone-p柱（0.5 mm×50 mm，60 μm，60 ?），流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為丙酮-乙腈-異丙醇溶液（1∶1∶1，V/V），

進(jìn)樣量80 μL。LC儀的分析柱為Hypersil C8柱（2.1 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。TurboFlow在線凈化梯度洗脫程序如表1所示，其中TFC每步的變化均采用瞬變模式，HPLC除最后一步采用瞬變模式外，其他步驟間的改變均采用漸變模式。TurboFlow在線凈化流路切換模式示意圖如圖1所示。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描模式；鞘氣壓力40 psi；輔助氣壓力30 psi；離子源溫度350 ℃；電噴霧電壓3 500 V；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓10 V；毛細(xì)管溫度350 ℃；四級(jí)桿1、四級(jí)桿3單位分辨率0.7。優(yōu)化得到其他測(cè)定條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

（F）QNs為兩性化合物，隨結(jié)構(gòu)的不同化學(xué)性質(zhì)略有差別。本研究分別采用甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑，比較各溶劑的提取效果。結(jié)果表明：對(duì)于極性稍強(qiáng)的化合物，如PIPA、ENO、MAR、NOR、FLE和OFL，甲醇的提取效果最佳，回收率與其他3 種溶劑相比較高；而對(duì)于極性稍弱的OXOA、DIF、NALA和FLU，乙腈的提取效果最佳；對(duì)于其他化合物，甲醇和乙腈的提取效果相當(dāng)，略高于酸性的甲醇和乙腈。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑，基質(zhì)外標(biāo)法校正的回收率均高于80%。

2.2 TurboFlow在線凈化條件的優(yōu)化

TFC在線凈化過程主要包括上樣、洗脫轉(zhuǎn)移、淋洗和條件化。本研究采用不接分析柱，分流進(jìn)質(zhì)譜方式優(yōu)化每一步的在線凈化條件。

在上樣步驟，本研究選擇0.5%甲酸溶液作為上樣流動(dòng)相，對(duì)陽(yáng)離子在線凈化柱（Cyclone MCX）和反相混合基質(zhì)在線凈化柱（Cyclone-p）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在Cyclone MCX柱上20 種目標(biāo)化合物不能完全保留，而在Cyclone-p柱上20 種目標(biāo)化合物均能有效保留，且在洗脫轉(zhuǎn)移一步能夠被完全洗脫，故選擇Cyclone-p作為在線凈化柱，0.5%甲酸溶液作為上樣流動(dòng)相。

洗脫轉(zhuǎn)移時(shí)需選擇合適的洗脫液，既要保證分析物被完全洗脫又不能影響分析物在分析柱上的分離。Cyclone-p為反相萃取柱，高比例的有機(jī)溶劑是洗脫的保證。洗脫環(huán)體積為200 ?L，洗脫時(shí)將凈化流路和分析流路合并，為稀釋洗脫溶液，凈化流路的流速較低（0.1 mL/min），分析流路的流速較高（0.5 mL/min）。在此條件下，采用不同比例的0.5%甲酸溶液與乙腈混合液洗脫目標(biāo)化合物，結(jié)果表明，當(dāng)混合洗脫液中乙腈的比例高于60%時(shí)，20 種目標(biāo)化合物能夠完全洗脫，但過高比例的乙腈會(huì)影響目標(biāo)化合物的峰型，當(dāng)混合洗脫液中乙腈的比例高于80%時(shí)，目標(biāo)化合物的峰型明顯變寬且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。因此選擇乙腈-0.5%甲酸溶液（60∶40，V/V）作為洗脫溶劑。

由圖2可知，上樣過程基本沒有損失，洗脫環(huán)中的溶液可以完全洗脫分析物（2 min內(nèi)）。

淋洗和條件化是目標(biāo)化合物在分析柱分離和質(zhì)譜檢測(cè)過程中，由凈化泵帶動(dòng)洗脫能力較強(qiáng)的溶劑對(duì)TFC柱進(jìn)行淋洗，并用洗脫溶劑充滿洗脫環(huán)，以備下一個(gè)樣品的分析。本研究選擇丙酮-乙腈-異丙醇（1∶1∶1，V/V）作為強(qiáng)洗脫溶劑，充分淋洗TFC柱，然后用0.5%甲酸進(jìn)行初始化。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵以10 μL/min的速率注入1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各化合物的最佳質(zhì)譜條件，包括選擇特征離子對(duì)、優(yōu)化電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、碰撞能量等條件。各化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)混合液進(jìn)入電噴霧電離源，分別在正、負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，得到分子離子峰。結(jié)果表明，各化合物均在正離子模式下有較高的響應(yīng)值，負(fù)離子模式下響應(yīng)值很低。然后對(duì)各分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，根據(jù)響應(yīng)值的大小確定定性、定量離子。優(yōu)化后目標(biāo)化合物的參考保留時(shí)間、母離子、子離子和碰撞能量如表2所示。

2.4 方法的線性和基質(zhì)影響

根據(jù)每種（F）QNs的靈敏度，用甲醇配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用雞肉空白樣品的提取液配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行測(cè)定。其中，ENO、DAN和CIN系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度均分別為0.2、0.5、2.0、5.0、20.0 ng/mL，其余（F）QNs系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL。用目標(biāo)化合物的峰面積與選定內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積比率對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)組分的質(zhì)量濃度作圖。

由表3可知，不同基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定的影響不同。豬肉樣品同樣存在基質(zhì)影響，需要用空白樣品提取液作為基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。對(duì)于CIP、NOR和ENR，因其有同位素內(nèi)標(biāo)，校正了基質(zhì)影響，使得空白樣品提取液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與甲醇溶液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相差不大；而其他化合物因沒有相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，色譜共洗脫組分的干擾對(duì)其電噴霧離子化存在抑制作用，導(dǎo)致空白樣品提取液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程響應(yīng)值較低。雖然3 個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)沒有抵消掉所有化合物的基質(zhì)影響，但可以校正提取和在線凈化過程的損失，提高方法的回收率和精密度。綜合考慮，本研究采用空白樣品提取液作為基質(zhì)的內(nèi)標(biāo)法定量分析目標(biāo)化合物。

2.5 方法的特異性

分別對(duì)20 種（F）QNs進(jìn)行測(cè)定，選擇信號(hào)值較高的2 組二級(jí)質(zhì)譜離子進(jìn)行定性及定量分析。由圖3可知，分析物均具有特征二級(jí)離子，輔之色譜分離，方法具有良好的選擇性。對(duì)雞肉和豬肉2 種基質(zhì)的空白樣品按優(yōu)化好的方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，均沒有干擾組分影響方法的定性及定量分析。

2.6 方法定量限

根據(jù)優(yōu)化所得色譜條件選取適當(dāng)濃度，對(duì)雞肉和豬肉空白樣品進(jìn)行20 種（F）QNs的添加實(shí)測(cè)，綜合考慮樣品的稀釋體積、儀器方法的進(jìn)樣量和其他干擾情況，以10 倍信噪比確定方法的定量限。

由表3可知，除ENO、DAN和CIN的定量限為2 ?g/kg外，其余化合物的定量限均為1 ?g/kg，完全滿足（F）QNs

殘留分析的要求。

2.7 方法的回收率和精密度

用不含（F）QNs的雞肉樣品進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。由表4可知，方法的回收率在85.4%～108.2%之間，3 個(gè)添加水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.04%～8.57%之間，方法回收率高，重復(fù)性好。用不含（F）QNs的豬肉樣品進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，方法的回收率在87.5%～110.4%之間，3 個(gè)添加水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.36%～9.02%之間，也具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室已采用該方法檢測(cè)了500余批次雞肉、豬肉等畜禽肉樣品，其中1 個(gè)樣品檢出有NOR殘留。由圖4～5可知，NOR的2 個(gè)特征離子對(duì)均出現(xiàn)，且豐度比與標(biāo)準(zhǔn)一致，因此判定測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性，定量測(cè)定結(jié)果為54 ?g/kg。

3 結(jié) 論

將TurboFlow在線凈化技術(shù)應(yīng)用于畜禽肉中20 種（F）QNs

殘留量的檢測(cè)中，采用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）提取目標(biāo)化合物，提取液經(jīng)在線固相萃取凈化，LC-MS/MS

測(cè)定。方法簡(jiǎn)單、快速、節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本和前處理時(shí)間，回收率高、重復(fù)性好，滿足國(guó)內(nèi)外的限量要求，適用于畜禽肉制品中（F）QNs殘留的定量及確證檢測(cè)，已應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)工作。

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