HMGB1 siRNA對(duì)缺氧復(fù)氧胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

胡 畔， 郭 凡

湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院湖北省中醫(yī)院&湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430061

高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高度保守的核蛋白，其可通過(guò)與Toll樣受體4和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體等細(xì)胞表面受體結(jié)合參與炎癥反應(yīng)，與多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。越來(lái)越多的研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，HMGB1在肝臟、腦和心臟等器官的缺血再灌注損傷中異常高表達(dá)，與組織細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，但其對(duì)胃缺血再灌注損傷的研究較少。研究HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制對(duì)臨床防治胃缺血再灌注損傷具有重要意義。缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型(A/R)是研究缺血再灌注損傷的經(jīng)典細(xì)胞模型[7-8]，本研究以人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞為研究對(duì)象，制備A/R細(xì)胞模型，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)GES-1細(xì)胞中HMGB1表達(dá)，觀察HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，旨在為胃缺血再灌注損傷的防治提供新線索。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自美國(guó)ATCC，DMEM/F12培養(yǎng)基和脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，HMGB1 siRNA和Control siRNA購(gòu)自Thermo公司。MTT試劑和二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，NF-κB p65抗體和IκB-α抗體、Cleaved caspase-3抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。總蛋白提取試劑盒和AnnexinⅤ-FIFC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自上海凱基生物公司，LDH ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific公司，ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、A/R組、A/R+siNC組、A/R+siHMGB1組。對(duì)照組：采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清)于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、體積分?jǐn)?shù)為20%的O2和溫度為37 ℃的正常條件下培養(yǎng)GES-1細(xì)胞。A/R組：采用無(wú)糖Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、94%的N2、1%的O2和溫度為37 ℃的三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行缺氧培養(yǎng)。3 h后，改換成DMEM/F12培養(yǎng)基，于正常條件下復(fù)氧培養(yǎng)5 h。A/R+siNC組：正常條件下培養(yǎng)GES-1細(xì)胞至細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)步驟將Control siRNA轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，參照A/R組的處理方式制備A/R損傷模型。A/R+siHMGB1組：正常條件下培養(yǎng)GES-1細(xì)胞至細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)步驟將HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，參照A/R組的處理方式制備A/R損傷模型。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力收集處理后的各組細(xì)胞，制備濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔2 ml種植于96孔板上。正常條件下培養(yǎng)24 h后，加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，反應(yīng)4 h后，再加入二甲基亞楓150 μl震蕩反應(yīng)10 min。以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm處的吸光度(OD)值，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集處理后的各組細(xì)胞，以質(zhì)量濃度為25 g/L的胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心5 min(離心半徑為10 cm)，并用磷酸緩沖液洗滌。加入1×結(jié)合緩沖液制備濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在含有1×105個(gè)細(xì)胞的試管中分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI避光反應(yīng)10～15 min。再補(bǔ)加400 μl結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5ELISA法檢測(cè)LDH含量收集處理后的對(duì)照組、A/R組、A/R+siNC組、A/R+siHMGB1組細(xì)胞，以每孔2 ml(濃度為1×106個(gè)/ml)種植于96孔板上，按照LDH ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中LDH含量。

1.6Westernblotting檢測(cè)HMGB1、NF-κBp65和IκB-α、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)參照試劑盒步驟提取對(duì)照組、A/R組、A/R+siNC組、A/R+siHMGB1組的總蛋白，并進(jìn)行定量。行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，加入特異性一抗和HRP標(biāo)記的二抗，充分反應(yīng)后，以ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。以目的蛋白的灰度值/內(nèi)參β-actin的灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組GES-1細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)比較經(jīng)A/R處理后，GES-1細(xì)胞中HMGB1表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后HMGB1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染Control siRNA后未能改變HMGB1的表達(dá)(P>0.05)(見(jiàn)圖1、表1)。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組GES-1細(xì)胞中HMGB1蛋白的表達(dá)Fig 1 The expression of HMGB1 protein in GES-1 cells of each group detected by Western blotting

2.2各組GES-1細(xì)胞活力的比較與對(duì)照組相比，A/R處理后GES-1細(xì)胞的存活率明顯降低，LDH含量明顯升高(P<0.05)；HMGB1 siRNA能抑制A/R引起的這一變化，使細(xì)胞存活率升高，LDH含量降低(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與A/R組相比，#P<0.05。

2.3各組細(xì)胞凋亡情況比較A/R處理后，GES-1細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，HMGB1 siRNA則能夠抑制A/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表3)。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與A/R組相比，#P<0.05。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況Fig 2 Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與A/R組相比，#P<0.05。

2.4各組細(xì)胞中TLR4、Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的比較與對(duì)照組相比，經(jīng)A/R處理后Bcl-2和IκB-α蛋白表達(dá)降低，Bax和NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；而HMGB1 siRNA能夠顯著上調(diào)Bcl-2、IκB-α和下調(diào)Bax、NF-κB p65表達(dá)，減弱A/R的作用(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、NF-κB p65和IκB-α蛋白的表達(dá)Fig 3 The expressions of Bcl-2, Bax, NF-κB p65 and IκB-α proteins in cells of each group measured by Western blotting

表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、NF-κB p65和IκB-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量Tab 4 The relative expressions of Bcl-2, Bax, NF-κB p65 and IκB-α proteins in each group

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與A/R組相比，#P<0.05。

3 討論

術(shù)后各種應(yīng)激因素(如失血性休克、創(chuàng)傷和血管炎等)通過(guò)釋放過(guò)量炎性介質(zhì)引起的胃黏膜細(xì)胞自由基過(guò)多、鈣超載和微循環(huán)障礙等胃黏膜損傷即為胃缺血再灌注損傷。探討胃缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制和改善途徑對(duì)各種術(shù)后并發(fā)癥的防治具有重要的意義。HMGB1是一種非組蛋白，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)受到應(yīng)激刺激時(shí)則會(huì)被釋放到細(xì)胞外液中，參與新陳代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等過(guò)程；作為與炎癥相關(guān)疾病關(guān)系密切的促炎因子，HMGB1一直是缺血再灌注損傷方面的研究熱點(diǎn)。上調(diào)HMGB1表達(dá)可通過(guò)激活TLR4信號(hào)通路刺激小鼠的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，加重腎缺血再灌注損傷[9]；而抑制HMGB1表達(dá)可減弱腦和肝缺血再灌注損傷[4-5]。HMGB1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是改善缺血再灌注損傷重要策略。例如，HMGB1中和抗體可通過(guò)抑制炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)大鼠心臟組織中凋亡基因Bax和Bcl-2的表達(dá)，減輕失血性休克/復(fù)蘇大鼠心臟損傷和細(xì)胞凋亡[10]；此外，采用HMGB1中和抗體能夠通過(guò)提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡改善缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[11]。目前，關(guān)于HMGB1與胃缺血再灌注損傷的研究較少。本研究為了探討HMGB1在胃缺血再灌注損傷中的調(diào)控機(jī)制，以人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞為研究對(duì)象，制備A/R細(xì)胞模型。采用常規(guī)生物學(xué)手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A/R處理后，GES-1細(xì)胞的存活率降低，HMGB1表達(dá)、LDH含量和細(xì)胞凋亡率升高。LDH是一種穩(wěn)定的胞漿酶，當(dāng)胞膜損傷時(shí)可被快速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，可被作為判斷細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)。利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)GES-1細(xì)胞中HMGB1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)GES-1細(xì)胞的存活率升高，HMGB1表達(dá)、LDH含量和細(xì)胞凋亡率降低。提示，HMGB1在胃缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著積極作用。

NF-κB是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB p65是其重要的成員之一，正常情況下NF-κB p65在細(xì)胞質(zhì)中可與抑制蛋白IκB-α結(jié)合形成復(fù)合體，當(dāng)受到外界刺激如缺血再灌注損傷時(shí)，IκB-α被磷酸化降解使NF-κB p65活化，激活NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖和凋亡等生理過(guò)程，與缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12-14]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中重要的抗凋亡因子和促細(xì)胞凋亡因子，兩者在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著作用[15]。本研究在制備的A/R細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和IκB-α蛋白表達(dá)下降，Bax和NF-κB p65蛋白表達(dá)升高；而轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后，A/R引起的這一變化得到部分緩解。已有研究[16-17]證實(shí)，下調(diào)HMGB1表達(dá)可抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，減輕視網(wǎng)膜組織缺血損傷；也可通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Caspase-3表達(dá)抑制缺氧/復(fù)氧的心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死后的組織損傷。結(jié)果提示，HMGB1可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化改善缺氧復(fù)氧引起的胃黏膜上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，缺氧復(fù)氧可引起胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞中HMGB1表達(dá)升高，下調(diào)HMGB1表達(dá)可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。HMGB1在胃缺血再灌注損傷中的扮演著重要角色，抑制HMGB1表達(dá)有望成為臨床改善胃缺血再灌注損傷的有效途徑。