改良的糞便脫落細胞富集方法的富集效率分析

張靜宜， 楊 靜， 鄒 明， 何玉琦， 盛劍秋

陸軍總醫院消化內科，北京 100010

結直腸癌在我國所有惡性腫瘤發病率中排名第3位[1]。然而，到醫院就診的結直腸癌患者多已到中、晚期，手術后5年內生存率僅為30%～50%。結腸鏡檢查是目前篩查結直腸腫瘤的金標準，但作為侵入性檢查，患者的接受率及依從性較低。文獻報道，即使是美國這樣的發達國家，也只有約60%的高危人群能夠進行結直腸癌結腸鏡篩查[2]，而在我國參與結直腸癌結腸鏡篩查的不足20%[3]。采用糞便或血液標志物篩查簡便易行，花費相對較低，但目前常用的血清腫瘤標志物(如CEA、CA199和CA242等)檢測的敏感性和特異性較低，無法應用于早期癌的篩查。糞便DNA檢測因其敏感性高、無創性的特點受到越來越多關注，已被美國預防服務工作組(USPSTF, U.S. Preventive Services Task Force)推薦為篩查項目[4]。但糞便結直腸癌DNA篩查所需檢查項目多，操作繁瑣，花費昂貴，以及由于人種間遺傳差異，美國人群中采用的糞便DNA標志物組合不適合我國國情。

健康人每天有數百萬細胞從腸壁脫落并通過大腸蠕動排出體外。在癌前病變和癌癥發展的各個階段，細胞也會脫落進入排泄系統，其中一些細胞含有與癌癥相關的基因突變[5]。提取糞便中的脫落細胞進行多靶點基因突變檢測，可以提早發現結直腸腫瘤。陸軍總醫院消化內科課題組從上世紀90年代中期開始研究糞便脫落細胞檢測技術診斷結直腸癌，開發出了糞便脫落細胞的保存液和糞便脫落細胞提取流程，明顯提高了結直腸癌的檢出率[6-7]。本次實驗我們通過改良的篩網淘洗法結合特殊納米磁珠富集脫落細胞，明顯提高了細胞富集率，并對富集到的細胞提取DNA和RNA檢測管家基因表達(β-actin和RNU6)，為后續進行突變基因分子生物學驗證提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料2015年10月至2016年6月陸軍總醫院消化內鏡中心進行結腸鏡檢查患者通過調查問卷確定高危人群[8]。收集患者年齡、性別、腫瘤部位、Duke’s分期等信息。排除標準：(1)伴有結直腸外的惡性腫瘤患者；(2)曾進行手術、放化療等治療；(3)結直腸癌患者同時患炎癥性腸病或其他自身免疫性疾病；(4)非原發癌灶者及不能確診的患者。本次研究獲得陸軍總醫院倫理委員會批準和患者的知情同意。

1.2試劑與器材腸道細胞液基保存液(本院自制)；蘇木精染液(Fluka公司)；伊紅染液(北京博爾西科技有限公司)；RNAprotect Cell Reagent(QIAGEN)；hNOK-hSeF單克隆抗體(清華大學醫學院)；納米磁珠(解放軍陸軍總醫院消化內鏡實驗室配制)；單克隆抗體-葉酸納米磁珠(北京化工大學配制)；DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；HOTStartTaq酶(大連寶生物工程公司)；d NTPs(2.5 mmol/L)(大連寶生物工程公司)；10×PCRBuffer(大連寶生物工程公司)；β-actin引物(上海生工生物技術公司)；引物試劑盒(德國QIAGEN公司)；瓊脂糖(瑞士Roche 公司)；PBS 干粉(北京索萊寶科技有限公司)；篩網30、100、200目(江蘇海門儀器廠)；臺式離心機(北京醫用離心機廠)；換氣消毒工作臺(北京航天科恩公司)；紫外燈(Upland 公司)；紫外分光光度儀752 型(上海光學儀器一廠)；實時定量PCR儀7500(美國Applied Biosystems 公司)；恒溫水浴箱(美國Polyscience公司)；恒溫震蕩器(HZ-9211K)(華利實驗設備公司)；CF-H260AI、CF-H290AI內鏡(日本奧林巴斯公司)；低溫冰箱(-80 ℃、-20 ℃)(德國西門子公司)。

1.3改良的糞便脫落細胞富集步驟患者于結腸鏡檢查當日清晨口服清腸藥，采用我中心研發專利《排泄物提取脫落的腸壁上皮細胞的裝置》[9](見圖1)，該裝置包括固定裝置(收集器主體)、收集裝置和收集瓶(可拆卸)，臀部與裝置接觸面設計為腎形，避免混雜尿液，排除泌尿系腫瘤的影響，收集器主體與收集瓶接合處安置濾網，初步過濾糞便中的雜質，過濾后的糞水進入收集瓶中，送至實驗室富集細胞。收集患者第4次清腸液，過濾后的糞水進入收集瓶中，送至實驗室富集細胞。含脫落細胞的糞水加入腸道細胞液基保存液后室溫下靜置約2 h，棄上清，留約100 ml，如果標本不夠100 ml，則加入細胞液基保存液至100 ml。標本經改良的篩網淘洗法(改進淘洗步驟和調整使用不同目數的濾網)淘洗后；濾液倒入50 ml離心管中，室溫下1 500 r/min離心10 min，離心半徑90 mm；棄上清，留約2 ml沉渣，加入免疫磁珠60 μl(hNOK/hSef 單克隆抗體-葉酸納米磁珠[10-11]，添加液基保存液至5 ml，吹打混勻，37 ℃恒溫箱中孵育；將細胞懸液倒入15 ml離心管；棄上清，液基保存液沖洗管壁，制成細胞懸液吹打均勻。富集到的糞便脫落細胞加入RNAlater中-80 ℃保存。

圖1 排泄物提取脫落的腸壁上皮細胞的裝置 Fig 1 Device for removing exfoliated epithelial cells from stool

1.4糞便脫落細胞中總DNA和RNA提取及內參基因檢測對糞便脫落細胞參照試劑盒操作說明書提取總DNA和RNA，分光光度計測定DNA濃度，NanoDrop測定RNA濃度，電泳檢測DNA和RNA完整性，qRT-PCR檢測細胞內參基因(β-actin和RNU6)信號，質控體系流程(見圖2)。

圖2 脫落細胞質量控制體系流程圖Fig 2 Flow chart of quality control system of exfoliated cells

1.5統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件，對年齡進行t檢驗，對性別、臨床類型等計數資料采用卡方檢驗和Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般資料本實驗共選取了52例結直腸癌和34例進展期腺瘤患者糞便脫落細胞標本，其中52例結直腸癌患者(TNM Ⅰ期和TNM Ⅱ期)，男40例，女

12例，年齡46～82歲，Ⅰ期癌患者19例，Ⅱ期癌患者33例；34例進展期腺瘤患者(腺瘤直徑>1.0 cm)，男20例，女14例，年齡45～77歲。另有16例結腸鏡檢查結果正常的作為陰性對照組，男8例，女8例，年齡30～70歲。臨床病例資料如表1所示。

表1 患者臨床資料Tab 1 Clinical pathological characteristics of patients

2.2特殊抗體-葉酸納米磁珠的制備根據hNOK和hSef的特點設計出抗原后免疫Balab/C小鼠，選取免疫反應最佳的小鼠，經過SP2/0融合、有限稀釋法篩選、制備腹水等過程，獲得hNOK和hSef的單克隆抗體[9-10]，與葡聚糖包覆四氧化三鐵磁性納米顆粒復合材料偶聯，離心去除多余抗體，制成包被葉酸和腫瘤單抗的特殊納米磁珠。

2.3qRT-PCR檢測細胞內參基因(β-actin)信號結果102例樣本的糞便脫落細胞懸液提取總DNA后，樣本內參基因(β-actin)信號均為陽性，富集效率為100%，PCR擴增曲線如圖3所示。

2.4qRT-PCR檢測細胞內參基因(RNU6)信號結果

102例樣本的糞便脫落細胞懸液提取總RNA后，OD值均在1.8～2.0，表明樣本未受到蛋白質、DNA或異硫氰酸胍的污染；電泳結果能清晰地顯示，5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA三條帶，說明RNA完整性較好(見圖4)。內參基因(RNU6)信號均為陽性，富集效率為100%，RNU6的PCR擴增曲線如圖5所示。

圖3 糞便脫落細胞內參基因(β-actin)PCR擴增曲線 Fig 3 PCR amplification curve of β-actin gene in fecal exfoliated cells

3 討論

國內現有的關于糞便脫落細胞檢測方法主要是運用離心淘洗、密度梯度離心、全糞便洗脫與免疫磁珠相結合的方法從糞便中提取脫落細胞后經HE染色涂片，進行病理學判斷，敏感性低，可能與以下因素有關：受到腸腔內多種理化、生物學因素的影響，脫落細胞的形態發生多種改變；糞便中混有大量的細菌、食物殘渣、膽色素及腸道黏液，使對細胞的分離和辨識存在一定的難度[7]。因此，單一的病理學診斷難以作為結直腸癌的診斷方法。

正常成人大腸黏膜上皮細胞以每小時1%的速度更新，每天大約有1×1010個正常的上皮細胞脫落，進入腸腔，最后隨大便排出。結直腸癌的腫瘤細胞生長旺盛，以超過1×109/cm2的速率脫落，如能以適當的方法充分富集糞便中的腸道上皮脫落細胞，從細胞中提取診斷標志物進行結直腸癌和結直腸腺瘤檢測，將大幅度地提高診斷的陽性率。近年來，學者們傾向于利用糞便中DNA的甲基化基因、micRNA作為診斷結直腸癌的標志物[12],但靈敏性和特異性高低不一，診斷意義低，這可能與細胞富集技術有關。

圖4 RNA 電泳顯示28s rRNA、18s rRNA

本次試驗除改良了篩網淘洗法，還首次采用hNOK/hSef單克隆抗體-葉酸磁珠法富集結直腸中的糞便脫落細胞。細胞表面以負電荷居多，因此我們將納米磁珠表面包被正電荷基團，吸附細胞，將細胞和黏液、糞渣等雜質區別開來。hNOK是新發現的酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，參與各臟器腫瘤的發生、侵襲、轉移[13]。hSef是能夠調節纖維細胞生長因子(FGF)信號通路的抑制因子，該通路在機體發育、血管生成和腫瘤發生、發展等過程中發揮重要作用，調節紊亂可導致某些癌癥的發生[14]。根據hNOK和hSef的特點設計出抗原后免疫Balab/C小鼠，選取免疫反應最佳的小鼠，經過SP2/0融合、有限稀釋法篩選、制備腹水等過程，獲得hNOK和hSef的單克隆抗體[10]。本試驗所用的hNOK和hSef單克隆抗體均來自清華大學醫學院實驗室，抗體滴度為1∶3 000，取得抗體后立即送至北京化工大學實驗室進行單克隆抗體-葉酸納米磁珠耦聯操作，最終獲得hNOK和hSef單克隆抗體-葉酸納米磁珠。該方法的優勢是，hNOK和hSef單克隆抗體利用免疫特性與細胞膜的抗原結合[14-15]。葉酸修飾的納米材料通過結合腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體靶向腫瘤細胞，外加磁力可使其富集，正常細胞則不受干擾[16]；二者共同發揮與癌細胞結合的作用，大幅度提高富集細胞的效率。

圖5 糞便脫落細胞中RNU6基因的PCR 擴增曲線 Fig 5 PCR amplification curve of RNU6 in in fecal exfoliated cells

在本研究中，qRT-PCR顯示，平均Ct值為30時，所有樣本均可見β-actin、RNU6信號均為陽性，富集效率均為100%，表明改良的糞便脫落細胞富集法有效率較高。通過糞便脫落細胞質量控制體系，我們可以得到含有穩定數量的消化道腫瘤細胞懸液，由此獲得的細胞懸液，可進一步用以檢測包含于腫瘤細胞中的潛在結直腸癌分子生物學標志物，為建立高準確性、無創性的結直腸癌篩查方法提供技術基礎。

本實驗首次建立了hNOK和hSef單克隆抗體-葉酸納米磁珠富集糞便脫落細胞的技術體系，為糞便脫落細胞的高效富集提供了新的簡單無創的方法，從而提高結直腸癌及癌前病變的非侵入性篩查的準確性。通過本實驗我們建立了糞便脫落細胞質量控制體系，該體系能夠簡單、快捷地鑒定糞便脫落細胞質量。