口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立

李井春

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110161）

口蹄疫是一種由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的，主要危害偶蹄獸的急性、熱性和高度接觸性人畜共患傳染病[1]。口蹄疫病毒共有O型、A型、C型、Asial型、SAT1、SAT2和SAT3等7個血清型，而每個血清型中又包括許多的亞型，且各個血清型之間無交叉保護(hù)[2]。鑒于口蹄疫是一種嚴(yán)重的“政治經(jīng)濟(jì)病”[3]，世界各國面臨的防控形勢均十分嚴(yán)峻。目前，世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了某些泛亞毒株和A型毒株的變異，重要的是這些變異毒株已經(jīng)在我國周邊國家發(fā)現(xiàn)[4-5]，對我國造成嚴(yán)重威脅。所以對口蹄疫病毒的快速監(jiān)測、檢測變得尤為迫切，以便在疫情發(fā)生時能確實(shí)實(shí)行“早、快、嚴(yán)、小”的有效防控措施。因此迫切需要建立快速、有效的口蹄疫檢測方法，以進(jìn)一步提高防控工作的準(zhǔn)確性、時效性。在此背景下進(jìn)行了口蹄疫病毒RT-LAMP診斷方法的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒RNA提取試劑購自天隆科技；RTLAMP檢測試劑盒購自北京藍(lán)譜生物 技；DEPC水及ddH2O、PBS本實(shí)驗(yàn)室自配；陽性對照使用蘭州獸醫(yī)研究所液相抗體檢測試劑盒的O型、AsiaI型和A型口蹄疫病毒抗原對照，陰性對照使用DEPC水；根據(jù)下載的FMDV保守基因區(qū)域，設(shè)計(jì)合成RT-LAMP引物，序列見表1。

表1 RT-LAMP引物序列Table 1 Sequences of primers of the RT-LAMP

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 依據(jù)天隆科技自動核酸提取說明書進(jìn)行。

1.2.2 系統(tǒng)優(yōu)化試驗(yàn) 以試劑盒核心組分鏈置換酶最適反應(yīng)溫度63℃為反應(yīng)溫度，分別進(jìn)行45 min和60 min RT-LAMP反應(yīng)，確定最適反應(yīng)時間；使用ddH2O稀釋內(nèi)外引物，分別以內(nèi)外引物比1:8和1:12進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，確定最佳內(nèi)外引物比例。

1.2.3 敏感性試驗(yàn) 利用分光光度計(jì)測定核酸初始濃度，再以PBS將提取的核酸分別稀釋10-3、10-4、10-5、10-6、2-1×10-6、2-2×10-6、2-3×10-6、2-4×10-6倍進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 選取A型、AsiaI、O型口蹄疫病毒抗原對照、豬瘟疫苗、藍(lán)耳病疫苗、圓環(huán)疫苗、偽狂犬疫苗和小反芻獸疫疫苗分別提取核酸后作為模板，應(yīng)用所建立的方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.5 應(yīng)用試驗(yàn) 應(yīng)用所建立的方法對4種口蹄疫疫苗進(jìn)行檢測，疫苗信息，見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化試驗(yàn) 優(yōu)化后確定反應(yīng)體系及程序?yàn)椋?×Buffer 12.5 μL，F(xiàn)IP（50 mm）1.2 μL，BIP（50 mm）1.2 μL，F(xiàn)3（10 mm）0.5 μL，B3（10 mm）0.5 μL， 酶 溶 液 1.0 μL， RNA 5 μL， DEPC 水3.1 μL，離心后的PCR管放入濁度分析儀內(nèi)，或置于已調(diào)好溫度的水浴鍋內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)條件設(shè)置：第一階段，63℃/60 min；第二階段，80℃/5 min。時間優(yōu)化、引物優(yōu)化結(jié)果分別見圖1和圖2。

表2 試驗(yàn)所用疫苗Table 2 Vaccines used in the RT-LAMP

2.2 敏感性試驗(yàn)FMDV初始濃度經(jīng)測定為20.082 μg/L，試驗(yàn)可檢出的最低濃度為在此濃度基礎(chǔ)上稀釋2-3×10-6倍，2-4×10-6稀釋度無擴(kuò)增曲線，見圖3。

圖3 敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of the RT-LAMP

圖1 反應(yīng)時間優(yōu)化Fig.1 Time optimization of the RT-LAMP

圖2 內(nèi)、外引物優(yōu)化Fig.2 Inner/outer primers Optimization of the RT-LAMP

2.3 特異性試驗(yàn)只有3種亞型口蹄疫病毒抗原對照有擴(kuò)增曲線，其他樣品均未擴(kuò)增出任何曲線，見圖4。

圖4 特異性試驗(yàn)Fig.4 Specificity test of the RT-LAMP

2.4 應(yīng)用試驗(yàn)4種口蹄疫疫苗樣品均有明顯的擴(kuò)增曲線，見圖5。

圖5 應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Detection results of Clinical samples by the RT-LAMP

3 討論

口蹄疫的有效控制關(guān)鍵在于早期檢測,準(zhǔn)確的檢測是防制口蹄疫的重要環(huán)節(jié)。近年來，F(xiàn)MDV的檢測技術(shù)發(fā)展迅速，建立血清學(xué)和分子生物學(xué)在內(nèi)的多種檢測方法。吳曉衛(wèi)等[6]建立了實(shí)時熒光RT－qPCR方法，楊洋等[7]建立了real-timeRT-RPA方法。這些方法具有特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但或存在耗時長，或需要昂貴的儀器進(jìn)行反應(yīng)；且以上方法的終點(diǎn)檢測均需要一定的設(shè)備支持。目前，對于FMDV的檢測金標(biāo)準(zhǔn)為病毒分離與鑒定[8]，但此方法同樣費(fèi)時、費(fèi)力、技術(shù)水準(zhǔn)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室不能進(jìn)行。RTLAMP檢測技術(shù)是近年發(fā)展起來的新型技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下方便、快速、靈敏、特異的檢測，已在多種主要動物病原體檢測上得到應(yīng)用[9-10]。蘭德松等[11]建立了豬瘟病毒通用型RT-LAMP檢測方法，與豬瘟熒光RT-PCR方法相比敏感性高10倍；楊卓等[12]建立了利用濁度分析儀檢測小反芻獸疫RT-LAMP的方法，可實(shí)時觀察反應(yīng)的進(jìn)行。RT-LAMP技術(shù)可通過反應(yīng)終產(chǎn)物是否形成白色沉淀可判斷擴(kuò)增有否進(jìn)行，如在反應(yīng)體系內(nèi)加入目視試劑，則終產(chǎn)物在紫外燈照射下發(fā)出明顯的綠色熒光就可判斷有擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，終點(diǎn)檢測非常易于判斷。如將RT-LAMP方法的各組分標(biāo)準(zhǔn)化組裝后，易于在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用，而且也利于開展現(xiàn)場診斷。本研究針對FMDV保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成6條特異性引物，成功建立了FMDV RT-LAMP檢測方法，為口蹄疫的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。