克羅恩病大鼠模型制備最佳TNBS與乙醇濃度的篩選實驗※

張 馳肖 玲劉 濤王園園張國山劉 密

（1 湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410007；2 湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410007）

克羅恩病（Crohn's disease，CD）是一種復雜的慢性炎癥性腸道疾病，可以影響胃腸道的任何部位，臨床主要表現為腹瀉、腹痛、直腸出血等，同時出現體重減輕、營養不良與貧血等慢性消耗癥狀或生長發育受阻等全身表現，是一種使人逐漸衰弱且無法治愈的終生性疾病，具體病因及發病機制至今未明確[1]。目前研究克羅恩病發病機制和評價治療效果的比較理想的模型制備方法[2]是參照Morris[3]于1984年首創的2，4，6-三硝基苯磺酸 (TNBS)動物模型。前期預實驗按照此造模方法以及其他相關的造模方法[4-6]，尚未達到比較理想的模型效果。為深入挖掘CD傳統造模方法，我們設計并進行了如下實驗，探討病變程度與造模各試劑濃度之間的關系，旨在尋求試劑最優濃度比，建立合適且較為穩定的克羅恩病動物模型。

1 材料與儀器

1.1 動物 SPF級雄鼠60只，體質量150～180 g，動物合格證號11401300071533，由廈門大學實驗動物中心[SYXK(閩)1216-0006] 提供。

1.2 藥品及試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，合肥博美生物科技有限責任公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，12140509）；10%水合氯醛（谷歌生物（長沙）生物科技有限公司）。

1.3 儀器 BA110S萬分之一電子天平（Sartorius公司）；DGG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；BM-Ⅱ型病理組織包埋機（安徽電子科學研究所）；石蠟切片機（德國Leica公司）；Nikon 80i顯微鏡（尼康公司）。

2 研究方法

2.1 分組及CD模型制作 60只大鼠隨機分為ABCDE 5組；適應性喂養1周后，禁食不禁水24 h；A組 (雙蒸水/無水乙醇)予以體積比為1∶1的雙蒸水、無水乙醇混合液按0.6 mL/只 （100~150 mg/kg） 灌腸；B組（2TNBS/50%乙醇） 予以體積比為2∶1的TNBS、50%乙醇混合液按0.6 mL/只（100~150 mg/kg） 灌腸；C組（TNBS/50%乙醇） 予以體積比為1∶1的TNBS、50%乙醇混合液按0.6 mL/只 （100~150 mg/kg） 灌腸；D組（2TNBS/無水乙醇） 予以體積比為2∶1的TNBS、無水乙醇混合液按0.6 mL/只 （100~150 mg/kg） 灌腸；E組（TNBS/無水乙醇） 予以體積比為1∶1的TNBS、無水乙醇混合液按0.6 mL/只（100~150 mg/kg） 灌腸；并另外注入0.2 mL空氣，將殘留在灌腸管（導尿管）中的混合液完全注入。灌腸后予以束縛倒立1 min，防止藥液倒流。每周重復以上步驟1次，并記錄老鼠的體重、糞便、一般行為學的變化；共進行4周。

2.2 取材及處理 造模4周后先將大鼠稱重，之后予10%水合氯醛腹腔麻醉，剖開腹腔，取距離肛門6~7 cm的病變明顯處1 cm結腸段，用PBS充分沖洗糞便，迅速放在10%甲醛溶液的EP管中保存。觀察大鼠結腸肉眼觀和鏡下組織學變化及腸道纖維化情況。

2.3 統計學方法 數據使用SPSS 22.0統計軟件處理，p＜0.05表示差異有統計學意義，多樣本均數比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 一般情況觀察 一般情況包括大鼠精神狀態、活動情況、鼠毛和耳廓色澤、糞便、肛周污跡、抓持等應激的反抗情況等。

實驗A組灌腸后大鼠精神狀態良好，食量正常，活動度可，反應機智靈敏，鼠毛整潔有光澤，排黃色成形軟便，未觀察到大鼠蜷縮腹部和弓背抬腹現象，無肛周污跡，無稀搪或黏液樣大便，墊料干燥無明顯臭味，鼠籠清潔。在整個造模過程中，大鼠體重穩步增加，未出現死亡情況。

實驗B組灌腸后大鼠精神狀態一般，食量減少，活動度欠佳，反應靈敏，鼠毛缺乏光澤，排黃色稀便略成形，肛周可見少許糞便附著，未觀察到大鼠蜷縮腹部和弓背抬腹現象無稀溏或黏液樣大便，墊料濕潤無明顯臭味，鼠籠清潔度稍差。B組第1次灌腸后2~3天逐漸出現倦怠懶動、食欲下降、腹瀉，稀便夾有黏液等癥狀。但在第2次灌腸前1~2天，觀察上述癥狀明顯好轉，體重有所回升。在第2次和第3次灌腸后，1周中出現上述癥狀的時間逐漸延長，至第4周時，上述癥狀已無改善的趨勢。在整個造模過程中，共出現2只大鼠死亡，解剖可見小部分結腸粘連。

實驗C組灌腸后大鼠精神狀態較差，食量明顯減少，活動度較差，反應稍遲鈍，鼠毛黯淡，排黃色稀溏黏液樣大便，肛周可見黃色糞便附著，有時可觀察到大鼠蜷縮腹部和弓背抬腹現象，墊料濕潤有明顯臭味，鼠籠清潔度差。C組第1次灌腸后2~3天逐漸出現倦怠懶動、食欲下降、腹瀉，稀便夾有黏液等癥狀，第4天癥狀達到高峰。但在第2次灌腸前1~2天，觀察上述癥狀稍有好轉，在之后的第2、3、4次造模后，共出現3只大鼠死亡，解剖可見部分結腸粘連，體重較前次造模前略有減輕。

實驗D組灌腸后大鼠精神狀態差，食欲減退，活動度差，反應遲鈍，鼠毛黯淡，排不成形黃色稀水樣便，帶有黏液；有時可見血液，肛周可見較多糞便附著，大鼠大部分時間呈蜷縮腹部和弓背抬腹現象，墊料濕潤明顯臭味，鼠籠清潔度很差。E組灌腸后出現大鼠死亡，解剖可見結腸脾區粘連，未見穿孔，腹腔少量血性腹水。大鼠在造模后第2~3天表現為肉眼可見暗紅膿血稀便，在之后的造模過程中，共出現4只大鼠死亡，上述的其他癥狀一直相對穩定；除體重緩慢減輕外，無其他明顯惡化的情況。

實驗E組灌腸后大鼠精神狀態極差，懶動，弓背蜷縮、扎堆、厭食消瘦，毛發變脆，豎毛，大鼠蜷縮腹部和弓背抬腹，排黏液膿血便，肛周附著大量黃褐色稀便，墊料臭味明顯，鼠籠清潔度極差。D組造模完成后前3天大便出現肉眼可見暗紅膿血的稀便，并在前2周造模前1~2天膿血消失，在之后的造模過程中仍為稀便，伴有膿血，食欲低下，進食量緩慢減少，倦怠懶動，毛色枯槁，形體瘦小，體重明顯低于其他組別。在第2、3、4次灌腸后均有大鼠死亡，該組大鼠死亡率較高，死亡情況分別為：2、3、4只。解剖可見結腸粘連嚴重，伴有透壁性炎癥及深大潰瘍；腹腔可見大量血性腹水，并發散出刺鼻的腐臭味。

表1 各組大鼠生存率 [只數(%)]

3.2 大鼠各時期肛周的情況及糞便含水率比較 見表2、圖1。

表2 各組別大鼠分辨含水率比較

表2 各組別大鼠分辨含水率比較

注：與正常組比較，*p＜0.05，**p＜0.01

組別 只數 均值0.1 7 3±0.0 3 4 0.2 3 3±0.0 6 7 0.2 9 8±0.0 2 2*0.3 2 0±0.0 7 3**0.3 5 5±0.0 2 9*A B C D E 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

圖1 特征性糞便及各組大鼠肛周情況圖

3.3 大鼠的體重變化 適應性干預1周之后，實驗組大鼠對比對照組灌腸后，體重均有所下降。而在第3周稱重時，大鼠的體重呈現緩慢增長趨勢。第4周稱重時大鼠依然表現出增長趨勢，實驗組組間比較可發現：D組后期增長的速度較為平緩，且低于其他組別。4組模型組大鼠與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組治療前后體重比較，見表3。

表3 各個時期大鼠的體重變化

表3 各個時期大鼠的體重變化

注：與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與同組灌腸前比較，#p＜0.05，##p＜0.01

3 2 3.2±1 2.2 2 5 7.1±6.4#2 6 2.6±5.6##2 3 9.0±1 1.4#2 3 1.8±6.8#組別 只數A組B組C組D組E組1 2 1 2 1 2 1 2 1 2第一周 第二周 第三周 第四周1 9 7.0±9.3 1 9 6.8±6.8 2 0 2.9±7.9 1 9 8.7±7.1 2 0 1.4±8.6 2 3 6.3±8.2 1 8 6.3±7.4*#1 8 5.2±9.7*#1 8 7.9±6.2*#1 9 1.9±1 0.3*##2 7 1.3±1 1.3 2 1 2.7±5.8 2 1 0.2±7.2#2 0 5.3±9.1##2 1 6.6±8.9

3.4 各組大鼠結腸形態特征比較 A組正常對照組大鼠結腸形態正常，黏膜光滑、無充血水腫，質軟，顏色淡紅，腸壁較薄，為正常的組織。可見結構黏膜上皮完整，大鼠結腸褶皺清晰，結腸袋明顯，腺管結構正常，固有層中極少見到單核細胞浸潤，血管透見結腸，基本無病理變化。B組大鼠造模后出現中度黏膜下炎癥，腸壁糜爛，未見潰瘍和粘連。C組大鼠潰瘍的范圍和程度均較D組小或輕，且組內大鼠間個體差異較大；除有較淺潰瘍和輕度纖維結締組織增生外，其余均表現為黏膜下輕、中度炎癥，未見肉芽腫形成。腸腔連續性水腫，黏膜彌漫性充血紅腫，黏膜表面可散見潰瘍形成，黏膜下層、肌層水腫增厚；某些節段發紅、稍扭曲，結腸壁稍增厚，腸腔稍有狹窄，腺管扭曲。鏡下杯狀細胞丟失，大量炎細胞浸潤，部分腸上皮細胞脫落壞死。D組大鼠出現透壁性炎癥，結腸壁可見非連續性糜爛、壞死及多個節段性深大潰瘍形成，腸壁與周圍組織粘連嚴重；偶見隱窩膿腫；潰瘍深達肌層，黏膜里典型的鵝卵石樣改變，病變部位腸壁明顯增厚，部分大鼠伴有腸道狹窄。鏡下黏膜下淋巴細胞浸潤較多；黏膜下有大量炎性細胞浸潤，結締組織增生伴腺體杯狀細胞減少，有典型肉芽腫形成。E組大鼠結腸結腸腸壁重度連續、彌漫性充血紅腫，散見糜爛面及出血點、潰瘍，腸腔內有大量膿性黏液生成，結腸袋及皺褶變淺變鈍甚至消失。縱行裂隙樣潰瘍灶形成，壞死大部分深入肌層，只保留部分腺體結構，黏膜層可見節段性透壁性壞死，部分腸上皮細胞化生，肌層明顯增厚，近端結腸擴張明顯，腸壁與局部腹膜、大網膜以及腸袢相互之間粘連。某些節段扭曲、變形、僵硬，部分腸段可見狹窄，近端結腸可有不同程度擴張。鏡下杯狀細胞消失，黏膜可見大量炎性細胞和中性粒細胞浸潤；黏膜上皮糜爛，腸上皮細胞壞死脫落，黏膜層缺失。見圖2~3。

圖2 各組大鼠結腸病變段肉眼視圖

圖3 各組大鼠結腸病變段顯微鏡視圖（×200倍）

4 討論

目前研究中使用的克羅恩病模型包括：自發性、細胞移植型、化學藥物誘導、基因型[7]CD動物模型，其中以化學藥物如碘乙酰胺、吲哚美辛、乙酸、葡聚糖硫酸鈉和TNBS誘導產生為主。本實驗選擇經典的造模方法，在此基礎上探尋最佳匹配濃度，建立的動物模型，并給予初步評價。

實驗結果顯示：對大鼠用TNBS直腸灌注后，外觀及組織切片與灌生理鹽水的對照組相比，模型組具有顯著的克羅恩病病樣[8]改變，提示克羅恩病模型造模成功。與生理鹽水組相比，其他不同模型組及組間的大鼠的一般行為學、糞便及含水量的測定、體重、組織病理學等指標的差異性較大，大鼠會有不同程度的厭食、皮毛無光澤、蜷縮少動、體重減輕以及黏液便等癥狀。病理特征方面，TNBS誘導的模型以結腸末端病變為主，急性期可見黏膜充血、出血、糜爛，偶見線性潰瘍。嚴重者全層透壁性壞死、腸上皮細胞壞死脫落，組織學可見中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，慢性期可見淋巴濾泡形成、隱窩變形，其病理改變類似于人類克羅恩病[8]。該動物模型與人體患克羅恩病的病理表現比較相似。

數據結果分析顯示：當TNBS量固定時，病變程度隨乙醇濃度增加而增大；當乙醇量固定時，病變程度隨TNBS量增加而增大；當灌腸混合液固定時，TNBS低于1/2量時，病變程度與乙醇濃度呈現正相關的關系；當TNBS超過1/2量時，病變程度與乙醇濃度呈現負相關的關系。此次實驗結果顯示：分析大鼠克羅恩病模型肉眼、鏡下觀及一般行為學等指標發現，D、E兩組造模效果較其他組別更顯著，D組體重增加較為平穩，且考慮E組大鼠的死亡率過高，故可選擇D組TNBS/無水乙醇體積比為2∶1混合液，作為制備克羅恩病大鼠模型的最優濃度比。

與傳統的克羅恩病模型相比，該模型與人體疾病發生更為接近，更貼近臨床疾病模型的要求，為克羅恩病的發病機制、以及中醫藥藥物的治療作用機理研究奠定了良好的基礎。另外，隨著科學技術的發展，基因型動物模型的研究也會越來越多，并且是從遺傳方面探究CD的發病機制，此次實驗可為今后更加深入研究CD提供良好的研究平臺，以達到可操作性強，為揭示CD的病理變化，指導臨床用藥提供可靠前期試驗的動物模型，并能為后期針灸等中醫特色治療與臨床用藥的對比實驗研究奠定基礎，以求更好的治療方法，提供良好的病理載體。