葛明膠囊總黃酮含量測(cè)定※

潘東明黃亦琦戚歡陽(yáng)郭詩(shī)妮馬雪云劉曉娟

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2 廈門(mén)市醫(yī)藥研究所 廈門(mén)市天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361008）

葛明膠囊由葛根、山楂、決明子、丹參等中藥制成，具有利濕化濁、活血通絡(luò)、潤(rùn)腸通便等功效[1]，除用于高血壓癥外，還可用于防治脂肪肝、肥胖癥[2-3]。方中葛根、山楂等藥物的降脂主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物[4-5]。本文擬將葛明膠囊中總黃酮含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化后，以葛根素為對(duì)照品，利用紫外分光光度法對(duì)葛明膠囊中的總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，為該復(fù)方中藥制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XS205電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg）；KQ-500VDB型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；SpectraMar M3酶標(biāo)儀（美國(guó)MoLecμLar Devices公司）；明澈TM-D24ΜV超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck MiLLipore公司）。

1.2 試藥與試劑 甲醇（批號(hào)20160902），無(wú)水乙醇（批號(hào)20160222），均為分析純（西隴化工股份公司）。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水系統(tǒng)自制雙蒸水。

標(biāo)準(zhǔn)品：葛根素 （批號(hào)110752-201313，純度95.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

飲片：丹參（批號(hào)161215），山楂（批號(hào)161219）購(gòu)自廈門(mén)燕來(lái)福制藥公司；決明子（批號(hào)1608270122），葛根（批號(hào)1611010072） 購(gòu)自亳州市滬譙藥業(yè)公司。經(jīng)廈門(mén)市醫(yī)藥研究所鑒定，丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖、山楂為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida var.major N.E.Brown的干燥成熟果實(shí)、決明子為豆科決明屬植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明 C.tora L.的干燥成熟種子、葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根。

樣品的制備：按照葛明膠囊配伍比例混勻各飲片粉末備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛明膠囊最佳提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的考察 精密稱(chēng)取6份樣品333.33 mg于10 mL容量瓶中，分別用甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇、水定容，先浸泡30 min，再進(jìn)行超聲處理（80 Hz，100%）30 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜；分別取不同溶劑提取的續(xù)濾液1 mL于50 mL容量瓶中，分別用甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇、水定容；在250 nm處測(cè)其吸光度A0；取甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇、水在250 nm處測(cè)其吸光度A。以△A（△A=A0-A）與不同濃度乙醇溶液的關(guān)系作圖，如圖1所示。不同提取溶劑在70%乙醇時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，選取70%乙醇為最佳提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的選擇

2.1.2 料液比的考察 精密稱(chēng)取5份樣品0.5 g，分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL70%乙醇，先浸泡30 min，再進(jìn)行超聲處理（80 Hz，100%） 30 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜；分別按不同料液比順序取續(xù)濾液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于50 mL量瓶中，加入70%乙醇進(jìn)行定容；在250 nm處測(cè)其吸光度A0；取70%乙醇在250 nm處測(cè)其吸光度A。以△A（△A=A0-A）與不同料液比提取的關(guān)系作圖，如圖2所示。不同料液比在1∶30時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，選取1∶30為最佳料液比。

圖2 不同料液比的選擇

2.1.3 超聲時(shí)間的考察 精密稱(chēng)取5份樣品333.33 mg于10 mL量瓶中，加入70%乙醇定容，先浸泡30 min，再進(jìn)行超聲處理（80 Hz，100%），時(shí)間分別為10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，后過(guò)0.45 μm微孔濾膜；分別取不同超聲時(shí)間提取的續(xù)濾液1 mL于100 mL容量瓶中，分別用70%乙醇定容；在250 nm處測(cè)其吸光度A0；取70%乙醇在250 nm處測(cè)其吸光度A。以△A（△A=A0-A）與不同超聲時(shí)間提取的關(guān)系作圖，如圖3所示。不同超聲時(shí)間在40 min時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，選取40 min為最佳超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間的選擇

2.1.4 超聲頻率的考察 精密稱(chēng)取3份樣品333.33 mg于10 mL量瓶中，加入70%乙醇定容，先浸泡30 min，再進(jìn)行超聲處理（100%）40 min，頻率分別為45 Hz、80 Hz、100 Hz，過(guò)0.45 μm微孔濾膜；分別取不同超聲頻率提取的續(xù)濾液1 mL于100 mL量瓶中，分別用70%乙醇定容；在250 nm處測(cè)其吸光度A0；取70%乙醇在250 nm處測(cè)其吸光度A。以△A（△A=A0-A） 與不同超聲頻率提取的關(guān)系作圖，如圖4所示。不同超聲頻率在45 Hz的△A為最高，選取45 Hz為最佳超聲頻率。

圖4 超聲頻率的選擇

2.2 葛明膠囊總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品1.00 mg，置5 mL量瓶中，用70%乙醇溶液定容，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品333.33 mg于10 mL量瓶中，加入70%乙醇定容，先浸泡30 min，再進(jìn)行超聲處理（45 Hz，100%） 40 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜；取續(xù)濾液1 mL于100 mL量瓶中，用70%乙醇定容。

2.2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葛根素對(duì)照品溶液分別置于5個(gè)干燥的10 mL量瓶中，用70%乙醇溶液定容，搖勻，在250 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算得回歸方程A=0.0946C-0.0069，R2=0.9998，結(jié)果表明在2～10 μg·mL-1線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 稱(chēng)取樣品1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)6次，測(cè)定其吸光度值，RSD為0.07%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)取樣品1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、5 h測(cè)定，結(jié)果放置5 h時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均未發(fā)生明顯變化，RSD為0.75%。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱(chēng)取樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行分析測(cè)定，RSD為1.48%。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取樣品9份，分別加入一定量的葛根素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。總黃酮的平均回收率為103.03%，RSD為2.45%，表明本方法準(zhǔn)確性良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn) （n=9）

2.2.8 樣品測(cè)定 取3批樣品，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果3批葛明膠囊中總黃酮的平均含量為18.11 mg·g-1。

3 討論

在最佳提取條件優(yōu)化的超聲頻率中分別考察了45、80、100 Hz，發(fā)現(xiàn)45 Hz的超聲頻率為葛明膠囊總黃酮提取的最佳超聲頻率，其可能的原因是45 Hz的超聲頻率較80、100 Hz的超聲頻率低，超聲場(chǎng)內(nèi)所產(chǎn)生的空化效應(yīng)，粉碎等作用強(qiáng)，故在此條件下葛明膠囊總黃酮成分的提取率較高。

以葛明膠囊中總黃酮含量作為最佳提取條件優(yōu)化的研究指標(biāo)。結(jié)果，單因素試驗(yàn)確定其最佳提取條件：70%乙醇為提取溶劑，以1∶30為料液比，40 min超聲時(shí)間，45 Hz超聲頻率。

本實(shí)驗(yàn)在此最佳提取條件下，采用紫外分光光度法測(cè)定了葛明膠囊中總黃酮，初步建立了該復(fù)方中藥的質(zhì)量控制方法，結(jié)果表明該方法不僅簡(jiǎn)便實(shí)用，而且其靈敏度高、重現(xiàn)性好，適合作為本制劑的質(zhì)量控制方法，還可以為其他中成藥及保健食品的質(zhì)量控制相關(guān)研究提供一定借鑒。