3種乳牙根管充填材料的抗生物膜活性研究

張睿，樊馬娟，方麗英，高作濱，劉楓

哈爾濱市兒童醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱 150010

由于乳牙的根管系統(tǒng)復(fù)雜且變異程度較大，以及對(duì)于兒童牙科操作和隔濕的困難，進(jìn)而給兒童牙科醫(yī)生進(jìn)行乳牙根管治療帶來(lái)挑戰(zhàn)。乳牙的根尖孔粗大，側(cè)枝根管較多，牙本質(zhì)小管容易暴露，加上乳牙生理性根吸收可能引起的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而增加微生物毒素滲透到牙根表面的可能性[1]。因此，從感染牙齒根管系統(tǒng)中消除生物膜是一個(gè)對(duì)于臨床治療來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn)。具有抗菌活性的根管充填材料在促進(jìn)菌群清除方面起著重要作用。以下幾種材料已被用作乳牙根管充填材料。在乳牙中，氧化鋅丁香油酚已被廣泛使用[2]。由于氧化鋅有刺激性強(qiáng)且不易被吸收的缺點(diǎn)，在其中加入抗菌活性和生物相容性較好且易吸收的碘仿或氫氧化鈣的產(chǎn)品也已經(jīng)進(jìn)入臨床使用[3]。Vitapex主要成分是氫氧化鈣和碘仿和聚硅氧烷油組成，具有卓越的抗菌活性和X射線阻射性，使用方便不需要預(yù)先調(diào)制糊劑，隨取隨用，而且不易污染。采用注射方式易于將糊劑充填至根管中，注射性可加壓充填方式解決了細(xì)彎幾側(cè)枝根管的充填難題，操作易于掌握，省時(shí)簡(jiǎn)便，一次性針尖可預(yù)防交叉感染[8]。Vitapex在氫氧化鈣糊劑中加入碘仿不僅增強(qiáng)防腐功能，而且兩者的生物相容性都很好。該糊劑中還有一定量的硅油，可使充填材料具有良好的流動(dòng)性和滲透性，有利于進(jìn)入乳牙豐富的側(cè)副根管中。而氧化鋅糊劑雖有良好的安撫鎮(zhèn)痛作用，但由于其作用時(shí)間短，對(duì)遠(yuǎn)期炎癥控制差，且氧化鋅可以被根尖滲出物浸潤(rùn)吸收，給炎癥的復(fù)發(fā)創(chuàng)造了一定的機(jī)會(huì)，此外，氧化鋅糊劑對(duì)根管壁的黏接性太強(qiáng)，減少了糊劑的流動(dòng)性，較難進(jìn)入側(cè)副根管，遺留滲出積儲(chǔ)的溫床，進(jìn)一步增加了炎癥。

近年來(lái)，活性染色和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）已成為一種廣泛使用的不同材料對(duì)單種和多種細(xì)菌生物膜的抗菌效應(yīng)的測(cè)量方法。生物膜是一個(gè)嵌入在胞外聚合物基體和附著在固體表面的微生物群落，細(xì)菌生長(zhǎng)在生物膜中產(chǎn)生持續(xù)性感染。微生物侵入根管系統(tǒng)，最終導(dǎo)致牙髓壞死、根尖周炎。在壞死根管內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)主要是游離的形式，根管治療的成功將取決于這種生物膜是否有效的消除[4]。該研究用活菌染色法和共聚焦激光掃描顯微鏡染色檢測(cè)常用乳牙根管材料的抗生物膜的能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（去離子水）、氧化鋅碘仿組、Vitapex組、氫氧化鈣組。

1.2 生物膜的培養(yǎng)

三十六羥磷灰石（HA）培養(yǎng)皿（0.38-inch直徑0.06-inch厚度，美國(guó)）作為生物膜的培養(yǎng)基。HA培養(yǎng)基加入Ⅰ型牛膠原白（10 mg/mL膠原蛋白）在4℃過(guò)夜。從健康成人志愿者中收集齦下菌斑，并在腦心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在分光光度計(jì)405 nm處調(diào)整細(xì)胞密度，密度約為7.5～107每毫升菌落形成單位。在厭氧條件下培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，用厭氧袋和厭氧指示劑在37℃條件下使菌斑懸浮。每個(gè)孔含有1.8 mL無(wú)菌腦心浸液培養(yǎng)基和0.2 mL接種物，樣品保存在水中。每周更換1次新鮮的培養(yǎng)基。

1.3 生物膜細(xì)菌存活率測(cè)定

在培養(yǎng)3周生物膜上，小心地放置一層薄薄的根管充填材料（0.1 g）。然后將標(biāo)本放入培養(yǎng)箱中，試驗(yàn)期為7 d和30 d（n=3）。用細(xì)菌存活試劑盒定量分析。按照制造商的指示在溶液中染色膜。使用激光共聚焦顯微鏡觀察。同時(shí)采用雙通道成像顯示綠色和紅色熒光。綠色熒光染色的為活菌，而受損的細(xì)菌膜染色產(chǎn)生紅色熒光。用Imaris 7.2軟件分析活/死的比率。紅色熒光到綠色熒光和紅色熒光的體積比表明死亡細(xì)胞的比例。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和Tukey分析死細(xì)胞體積的比例。

2 結(jié)果

共分析了180個(gè)掃描的生物膜區(qū)域，分別為紅色和綠色熒光的比例。不同根管材料的微生物殺滅效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝73.073，P＜0.05）。 致死微生物的比例也取決于暴露時(shí)間。在陰性對(duì)照組，經(jīng)過(guò)7 d的細(xì)菌細(xì)胞93%是活菌，30 d后為94%，Vitapex都對(duì)生物膜最有效的材料，見表1、圖1。

表1 不同根管充填材料對(duì)生物膜中死菌體積的比例（±s）

表1 不同根管充填材料對(duì)生物膜中死菌體積的比例（±s）

組別7 d 3 0 d對(duì)照組氧化鋅碘仿組V i t a p e x組氫氧化鈣組0.0 8±0.0 6 0.3 5±0.6 4 0.4 8±0.4 3 0.1 6±0.7 8 0.0 6±0.0 4 0.3 4±0.0 8 0.5 1±0.1 4 0.1 9±0.1 0

圖1 不同根管充填材料對(duì)生物膜中死菌的激光共聚焦結(jié)果

3 討論

乳牙根管充填材料用于的抗菌作用已在瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)或直接接觸試驗(yàn)有很多的研究，但這些研究都有很大的局限性，不適合于研究生物膜的微生物殺滅[5-6]。因此，很少有關(guān)于這些材料對(duì)根管生物膜的研究。到目前為止，只有少數(shù)使用激光共聚焦顯微鏡和雙組分的染色法評(píng)價(jià)根管充填材料對(duì)乳牙進(jìn)行抗菌作用的研究。這種方法目前常用于評(píng)價(jià)不同材料對(duì)根管感染微生物的抗菌效果，并提出了一種快速和相對(duì)容易使用的方法[7]。試劑盒中的兩種物質(zhì)在進(jìn)入正常和損傷細(xì)菌細(xì)胞的能力是不同的；活的細(xì)菌細(xì)胞膜完整的綠色熒光，而損傷的細(xì)胞膜則為熒光紅。認(rèn)為生物膜的各種不同的細(xì)菌存在于根管系統(tǒng)的不可到達(dá)區(qū)域，并且在這些區(qū)域中微生物一般代謝率較低，并且往往對(duì)抗菌劑有較強(qiáng)抵抗力[8]。因此，根管充填材料應(yīng)利用多物種生物膜模型測(cè)試其抗菌能力。

該研究結(jié)果表明，不同根管材料在殺滅生物被膜的效果上存在顯著差異。氫氧化鈣對(duì)生物膜表現(xiàn)出微弱的影響。氫氧化鈣對(duì)游離培養(yǎng)中生長(zhǎng)的根管細(xì)菌有較強(qiáng)潛力。然而，對(duì)生物膜的影響是不確定的。此外，沖洗根管的藥物一般為次氯酸鈉溶液，這樣的結(jié)果較難維持高濃度的氫氧根離子[9]。

氧化鋅碘仿在很短的時(shí)間有抗菌作用。盡管有一些研究表明含有氧化鋅的物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗菌作用，但其他研究顯示只有有限的抗菌活性，這種差異可以用瓊脂擴(kuò)散法中的混雜因素、不同種類的細(xì)菌測(cè)試和丁香酚的濃度來(lái)解釋[10]。該研究結(jié)果表明，氧化鋅對(duì)生物膜微生物表現(xiàn)出中等程度的活性。一旦設(shè)定了氧化鋅，它就沒(méi)有特別的抗菌作用，這可以解釋7 d后暴露的生物膜細(xì)菌為什么沒(méi)有被殺死。

Vitapex在乳牙根管治療療效臨床和影像學(xué)成功可能與在與活體組織接觸時(shí)，其抗菌性能和快速吸收材料的獨(dú)特性能有關(guān)。我們的研究結(jié)果表明，與其他研究一致[11]，認(rèn)為Vitapex的良好的性能是由于碘仿，因?yàn)榈夥聠为?dú)也導(dǎo)致近70%的生物膜的細(xì)菌殺死。

根管充填材料的抗菌效果對(duì)于牙髓治療的成功是至關(guān)重要的，它不是理想材料所需要的唯一特性，應(yīng)該進(jìn)行更多的研究來(lái)評(píng)估乳牙牙髓治療材料的其他生物學(xué)特性。