miR-224通過調控同源異型盒基因B3表達對大腸癌細胞增殖、凋亡的影響

李青春,薛軍花,李文革,邢國強

(陜西省渭南市第一醫院 普外科,陜西 渭南,714000)

大腸癌包括結腸癌、直腸癌，是常見的惡性消化道腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。在英美等發達國家中，大腸癌是男性第3位常見腫瘤，僅次于肺癌和前列腺癌，而在女性中是第2位常見腫瘤，僅次于乳腺癌[1-2]。大腸癌的發病機制尚不明確，癌基因的激活與抑癌基因的失活，信號通路的改變，生活環境，飲食結構的變化都可能誘導其發生[1-2]。臨床研究[3]證實，早期大腸癌患者5年生存率可達90%,但晚期發生轉移者5年生存率僅為15%。本研究探討HoxB3在大腸癌細胞增殖凋亡中的作用機制，并通過雙熒光素酶實驗、Western blot及RT-PCR來進一步驗證其是否是miR-224的靶基因，以及miR-224影響大腸癌細胞增殖凋亡的可能機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株: 大腸癌HCT 116,RKO,SW 480,Caco-2,LoVo,HT-29細胞購于中國科學院細胞庫，目錄號分別為: TCHu 99,TCHu 116,TCHu 172,TCHu 146,TCHu 82,TCHu 103;人正常結腸直腸黏膜上皮細胞HIEC購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器: 兔抗CDCA 3,CyclinD 1,p21,p27單克隆抗體(Epitmics公司);兔抗HoxB3多克隆抗體(Abcam公司);四甲基偶氮唑鹽(Gibco公司);胎牛血清,RPMI-1640培養基(Hyclone公司)。野生型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Wt,突變型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Mut,pcDNA 3.1-HoxB3,pcDNA 3.1-NC(Invitrogen公司);miR-224 inhibitor及miR-224 NC(廣州市銳博生物科技有限公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀(北京六一儀器廠);ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(Bio-Rad公司);熒光素酶活性檢測系統Dual-Luciferase Reporter System(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞活力: 將細胞接種于96孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC。48 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT,繼續培養4 h后吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO,震蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測OD值，以630 nm作為參比波長計算相對增殖率[4]。

1.2.2 AnnexinV-PI流式雙染檢測細胞凋亡: 將細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC。按試劑盒說明書進行操作，并進行上機檢測。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0.25%的胰蛋白酶消化,PBS洗滌,2 000 轉/min離心5 min,收集細胞;按順序分別加入500 μL Binding Buffer,5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI 5,混勻，于室溫避光反應10 min,在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.2.3 細胞周期實驗: 將細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,轉染達到48 h后，消化細胞，避光上機檢測。加入70%乙醇，輕輕吹打混勻,4 ℃固定2 h,1 000 轉/min,離心5 min。PBS重懸并離心，加入0.5 mL PI染色液，重懸細胞,37 ℃避光反應30 min,上機檢測。

1.2.4 RT-PCR: 參考trizol試劑盒(Invitrogen)使用說明書提取總RNA,整個提取處于無核糖核酸酶(RNAase)的環境下。引物如下: miR-224上游引物: 5′-GAGCCCAAGTCACTAGTGGT-3′,下游引物: 5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;HoxB3上游引物: 5′- GAATTCATGCAGAAAGCCACCTACTAC-3′,下游引物: 5′- CTCGAGTCACAGGTGTGTTAATTTG-3′;GADPH上游引物: 5′- AGCCACATCGCTCAGACA-3′,下游引物: 5′- TGGACTCCACGACGTACT-3′。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取5 μL擴增產物用于下一步2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應體系中，反應條件為94 ℃變性45 s,59 ℃復性45 s,72 ℃延伸60 s,共35個循環。

1.2.5 Western blot: 在收集到的細胞中，加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s,40 min后,4 ℃、10 000轉/min離心10 min,小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉膜。將膜浸入一抗溶液孵育,4 ℃過夜;漂洗后，浸入二抗溶液(1∶100)中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。采用Quantity one軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

1.2.6 熒光素酶報告基因表達分析: miR-224及HoxB3重組載體共轉染到HCT 116細胞中。分組如下: miR-224 inhibitor+Wt HoxB3,miR-224 NC+ Wt HoxB3,miR-224 inhibitor+Mut HoxB3,miR-224 NC+ Mut HoxB3。應用雙熒光素酶檢測系統檢測轉染好的熒光素酶活性，步驟如下: PBS洗滌3次，加入PLB裂解液，充分裂解后加入LAR溶液，雙報告系統熒光素酶檢測儀讀取熒光值，加入終止液，再次讀取熒光值，計算相對熒光值。計算公式: 相對熒光值=螢火蟲熒光素梅熒光值/海腎熒光素梅熒光值。

2 結 果

2.1 miR-224在大腸癌細胞株及人正常結腸直腸黏膜上皮細胞HIEC的表達

通過RT-PCR證實，大腸癌HCT 116、RKO、SW480、Caco-2、LoVo、HT-29細胞中miR-224的表達比值依次為(1.01±0.11)、(0.74±0.04)、(0.71±0.05)、(0.72±0.02)、(0.85±0.02)、(0.76±0.11),顯著高于人正常結腸直腸黏膜上皮細胞HIEC的表達比值(0.20±0.02),其中在HCT116中的表達量最高，選為后續實驗研究對象。

2.2 miR-224 inhibitor對HCT116細胞活力和凋亡的影響

HCT 116細胞轉染miR-224 inhibitor后，經MTT實驗發現，與對照組比較，轉染組中細胞活力顯著下降(P<0.01)。經AnnexinV-PI實驗發現，與對照組比較，轉染組中細胞凋亡數目顯著上升。見圖1、2。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖1 miR-224 inhibitor對HCT116細胞活力的影響

圖2 miR-224 inhibitor對HCT116細胞凋亡的影響

2.3 熒光素酶報告基因表達分析

將miR-224 inhibitor、miR-224 NC及野生型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Wt及突變型載體pGL 3- HoxB3 3′UTR-Mut轉入HCT 116細胞中，結果發現miR-224 inhibitor與野生型載體pGL 3- HoxB3 3′UTR-Wt共轉染組的熒光信號強度顯著弱于其他轉染組(P<0.01)。對于突變型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Mut,各組間熒光強度無顯著差異(P>0.05),見圖3。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖3 熒光素酶報告基因表達分析

2.4 miR-224 inhibitor對HCT116細胞中HoxB3蛋白及mRNA表達的影響

將miR-224 inhibitor、miR-224 NC轉染到HCT116細胞后,HoxB3蛋白及mRNA表達量均顯著降低(P<0.01)。見圖4。

與miR-224 NC組比較,**P<0.01。

圖4miR-224inhibitor對HCT116細胞中HoxB3蛋白及mRNA表達的影響

2.5 HoxB3表達下調后對HCT 116細胞活力和凋亡的影響

HCT 116細胞轉染pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC后，經MTT實驗發現，與NC組比較，轉染組中細胞活力顯著下降(P<0.01)。經AnnexinV-PI實驗發現，與NC組比較，轉染組中細胞凋亡數目顯著上升。說明miR-224 inhibitor或者siRNA都能抑制HoxB3表達，從而降低大腸癌HCT 116細胞活力并誘導細胞凋亡。見圖5、6。

與pcDNA 3.1-NC組比較, ??P<0.01。圖5 HoxB3表達下調后對HCT 116細胞活力的影響

圖6 HoxB3表達下調后對HCT 116細胞凋亡的影響

2.6 miR-224 inhibitor對HCT116細胞周期的影響

HCT 116細胞轉染miR-224 inhibitor后，能使HCT 116細胞周期阻滯在G1期。見圖7。

圖7 miR-224 inhibitor對HCT 116細胞周期的影響

2.7 miR-224 inhibitor對HCT116細胞周期相關蛋白表達的影響

HCT 116細胞轉染miR-224 inhibitor后，能顯著下調細胞分裂周期相關蛋白3(CDCA3)及細胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達，上調p21及p27表達。見圖8、9。

3 討 論

大腸癌的發生和發展是一個多因素、多步驟的過程，最終表現為癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究[5]證實miRNAs在大腸癌的早期診斷、臨床分期中具有顯著標記性，在多種腫瘤中異常表達，與包括大腸癌在內的多種腫瘤的發生發展密切相關。miRNAs是一類進化上高度保守的內源性非編碼小分子RNA,它能夠結合于靶基因mRNA的3′-UTR區域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因表達。研究[6]顯示miR-224參與多種腫瘤細胞的細胞分化、增殖、凋亡及細胞周期等生物學過程。在肝癌、乳腺癌及結腸癌瘤組織中miR-224的表達都呈現上調趨勢[6]。也有少量研究[7-11]證實大腸癌組織中miR-224的表達顯著高于正常癌旁組織，并作為大腸腺癌患者獨立預后因子參與大腸癌的發生發展。miR-224對于大腸癌細胞增殖及凋亡的影響的具體機制尚無報道，有研究[12]顯示,miRNA能異常調節腫瘤增殖，與調節惡性腫瘤細胞中DNA甲基化和組蛋白修飾有關。同源異型盒基因(Hox)的異常表達對于致癌基因和腫瘤抑制因子有重要作用。miR-28-5p在結腸癌中調控HoxB3表達[13]。HoxB3在大腸癌HCT116、RKO、SW480細胞中表達異常[14]。HoxB3是Hox家族中的一種，能夠在某些癌癥中影響癌基因啟動子通路和腫瘤代謝。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖9 miR-224 inhibitor對HCT 116細胞中p21及p27表達量的影響

與腫瘤相關的miRNA可通過調節惡性腫瘤細胞中DNA甲基化和組蛋白修飾從而改變表觀遺傳的表型。Hox基因在腫瘤組織中的異常表達對于致癌基因和腫瘤抑制因子有重要作用。Ferrando等[15]發現Hox基因及其輔助因子導致了白血病的發生,Care等[16]發現Hox基因通過促血管生成導致了乳腺癌的發生。Hox家族基因最初是由Mcginnis等在果蠅染色體中發現的，后相繼在鼠和人類等哺乳動物染色體中發現。Hox基因是一段高度保守的DNA序列，約有183 bp,并含有61個氨基酸組成的同源域。同源域含有一個螺旋-轉-螺旋的構型，能特異性地識別以5′-TAAT-3′為核心的DNA序列，進而結合DNA,最終調節下游靶基因的表達[17]。Hox基因家族含有39個基因，分為4簇，分別為HoxA、HoxB、HoxC和HoxD。HoxB3屬于HoxB簇，對其研究報道較少，但已有研究[18-19]證實HoxB3在乳腺癌、裸鼠多發性骨髓、急性白血病、乳腺癌、卵巢癌中表達異常，并與其預后不良密切相關。HoxB3在大腸癌HCT116、RKO、SW480細胞中表達異常[13]。在前列腺癌組織中HoxB3蛋白及mRNA高表達，當下調前列腺癌PC-3細胞中HoxB3的表達，能顯著抑制體內外腫瘤細胞的增殖[20]。miR-10a通過靶向調節HoxB1和HoxB3的表達，從而調控胰腺癌的生物學行為[21]。提示HoxB3與癌細胞增殖密切相關，并可作為miRNA靶蛋白，影響腫瘤細胞的增殖等生物學行為。

本研究結果證實,miR-224在大腸癌細胞中的表達高于人正常結腸直腸黏膜上皮細胞HIEC中的表達，在大腸癌中發揮類似癌基因的作用，與上述報道結果一致。通過MTT法及Annexin v-PI實驗發現，下調miR-224表達水平后能顯著抑制大腸癌細胞的增殖，并誘導其凋亡。進一步通過雙熒光素酶報告基因證實HoxB3是miR-224下游靶基因,Western blot及RT-PCR結果證實，下調miR-244的表達水平后HoxB3蛋白及mRNA表達量都顯著下降，提示miR-224可能通過靶向HoxB3 mRNA而影響大腸癌細胞的增殖凋亡等生物學行為，但是miR-224的靶基因可能有多個，如miR-224在肝癌中顯著性上調表達，通過降低凋亡抑制因子-5(API-5)參與細胞凋亡[22]。在卵巢癌中,miR-224通過靶作用上皮細胞特異性蛋白1(KLK10)促進腫瘤細胞增殖，此作用呈劑量依賴性[23]。本研究通過干擾大腸癌細胞中HoxB3的表達來模擬大腸癌細胞中miR-224表達量的下調，結果顯示通過下調HoxB3表達水平能顯著抑制大腸癌細胞的增殖，并誘導其凋亡，從而反向驗證了miR-224是通過靶向HoxB3的表達而干擾大腸癌細胞的增殖凋亡。

Olaru等[24]報道miR-224在炎性腸病(IBD)中通過調節G1-S檢測點及負調控p21表達參與IBD的致癌作用。G1期處于增殖細胞唯一能夠接受外界增殖與增殖抑制信號的時期，是細胞能否進入細胞周期的關鍵點。其中CyclinD1是G1期關鍵蛋白，最先在G1期被合成，在G0/G1期到S期的進程中發揮關鍵作用。細胞分裂周期相關的3(CDCA3)、部分的SKP1的cullin-F-box(SCF)泛素連接酶，指的是一個觸發進入有絲分裂和有絲分裂抑制激酶介導的破壞。p21和p27是細胞周期依賴性激酶抑制劑，能分別抑制CyclinD1與細胞周期依賴蛋白激酶(CDK4)結合,CyclinE-CDK2結合，使細胞不能通過G1期。本研究在此基礎上繼續探討miR-224表達水平下調后對于大腸癌細胞增殖，凋亡干預作用機制，流式細胞術結果發現miR-224 inhibitor能使大腸癌細胞周期阻滯在G1期，同時經Western blot發現,CDCA3、CyclinD1表達量下調,p21及p27表達量上調。說明miR-224能通過調節細胞周期相關蛋白的表達，從而使細胞周期阻滯在G1。Chen等[20]通過芯片ChIP技術發現,HoxB3能結合于CDCA3啟動子區域，反式激活CDCA表達。Uchida等[25]證實CDCA3在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中過表達，用shRNA干擾OSCC細胞中CDCA3的表達后，能顯著抑制腫瘤細胞的增殖，使細胞周期阻滯在G1期，并上調p21及p27等蛋白的表達，提示miR-224對大腸癌細胞周期的阻滯作用機制可能是通過靶向HoxB3實現的。

綜上所述,miR-224在大腸癌細胞中高表達，并能通過調控靶基因HoxB3的表達參與大腸癌細胞的增殖與凋亡，且此過程與下調CDCA3及CyclinD1表達，上調p21及p27表達，并使細胞周期阻滯在G1期有關。