珠海市2011—2016年諾如病毒胃腸炎暴發疫情的分子流行病學研究

張麗榮 林毅雄 李紅霞 周蘭蘭 黃輝濤 魏泉德

諾如病毒(norovirus)也叫諾瓦克病毒(norwalk virus,NV),為單股正鏈RNA病毒,是引起急性非細菌性胃腸炎的一組無包膜病毒。屬于杯狀病毒科,根據病毒聚合酶和結構蛋白(VP1)氨基酸序列差異,NV被分為7個基因群(GI～GVⅡ),GⅠ和GⅡ是造成人類感染的主要型別,基因群再分為不同的基因型［1］,而眾多基因型中,GⅡ4是2014年之前全世界范圍內流行的最主要型別［2］,而在2014—2015年流行季GⅡ17成為優勢株［3］,隨后有 GⅡ3、GⅡ17、GⅡ.p16-GⅡ.2等多種流行株出現。NV變異速度快,可通過點突變積累或基因重組而產生突變株或新毒株,一般每隔2～3年便會出現新的變異株,從而引發大流行。

NV在全球范圍廣泛分布,在我國絕大多數地區都有發現及報道［5-6］。NV的傳播能力很強、不僅可通過糞-口途徑傳播,還可通過氣溶膠顆粒以及通過直接接觸被污染的物品傳播,因此,在學校、幼兒園、餐館、療養院、工地、公司、旅行團等人群聚集的地方易發生聚集性或暴發疫情,NV疫情發生率存在地區差異,南方高于北方,沿海高于內地,城市高于農村。

近年來,NV感染情況較為嚴重,珠海市每年都有多起NV感染引起的暴發疫情。為更好地了解和掌握本地區NV病原特征和流行規律,進行科學的預警和防制,對珠海市2011—2016年引起暴發疫情的NV進行分子流行病學分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2011—2016年珠海市的56起急性NV胃腸炎暴發疫情病例肛拭子標本,其中2011年3起,2012年7起,2013年9起,2014年5起,2015年14起,2016年18起,標本總數共計576份,疫情主要發生在學校和幼兒園。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集及處理:采集發病當日的病例肛拭子標本放入裝有2～3 ml無菌PBS緩沖液的Eppendorf管中冷藏于10℃以下,2 h內送達實驗室并立刻開展檢測,標本置于漩渦振蕩器震蕩15 s混勻,取上清,4℃暫存。

1.2.2 RNA提取:使用QIAamp Virul RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA,提取步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 實時熒光RT-PCR檢測:上海輝睿生物技術有限公司生產的NV實時熒光RT-PCR檢測試劑盒,含GⅠ﹠Ⅱ型,實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 RT-PCR檢測:從每起急性NV胃腸炎疫情的陽性標本中,隨機選擇3～4份陽性標本,做RTPCR檢測。分別針對NoV GⅠ和NoV GⅡ的ORF2衣殼蛋白區設計引物,引物序列詳見表1。RT-PCR擴增試劑為TaKaRa One Step RNA PCR Kit,反應體系總體積25 μl,反應條件為:50℃反轉錄35 min；95℃預變性5 min；95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸60 s,35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果并切膠回收。

表1 NoV GⅠ/NoV GⅡ RT-PCR擴增引物Tab.1 RT-PCR primer sequenses for NoV GⅠ/NoV GⅡdetection

1.3 核苷酸序列測定和分析 因同一起疫情的標本檢出的型別相同,故每起疫情選1株共計56株做種系進化分析,RT-PCR擴增產物由美吉生物醫藥科技有限公司測序。序列結果用Clustal X、DNA Star軟件拼接,通過NCBI的BLAST比對分析,選取同源性較高的、年份較近的、地域不同的參考株序列,、用 Mega7.0軟件采用 Neighbour joining的bootstrap重復計算500次構建系統進化樹。

2 結果

2.1 實時熒光RT-PCR法檢測結果 2011—2016年珠海市的56起急性NV胃腸炎聚集性及暴發疫情的病例,經實時熒光RT-PCR法檢測,都是GⅡ群,未檢出GⅠ群,總計576份標本的檢測結果見表2。每起疫情選取3～4份NV核酸陽性標本,共計203份標本全部為NoV GⅡ型。

2.2 序列比對與進化分析 樣品株按照疫情暴發時間由先到后編號,年份后以英文字母順序排列,測序得到的NV核苷酸序列剔除兩端的引物序列后,進行核苷酸序列編輯、經BLAST搜索比對及多序列同源性比對分析；用N/J法繪制遺傳進化樹后發現56株均為GⅡ群,可分為8個基因亞型,其中GⅡ.4亞型有4株與GⅡ.4 2006 b分到同一簇,另外4株與GⅡ.4/Sydney分到同一簇,14株與GⅡ.3型參考株分到同一簇,14株與GⅡ.17型參考株分到同一簇,5株與GⅡ.6型參考株分到同一簇,2株與GⅡ.7型參考株分到同一簇,1株與GⅡ.5型參考株分到同一簇,12株與GⅡ.p16-GⅡ.2參考株分到同一簇。遺傳進化樹見圖1。

表2 2011—2016年胃腸炎疫情諾如病毒核酸檢測數據Tab.2 Detection results of norovirus gastroenteritis outbreaks in Zhuhai during 2011-2016

按照檢測樣本的采集年分析,如表3所示,2011年6月的為GⅡ.4 2006b；2011年11月2起都是GⅡ.7；2012年上半年3起是GⅡ.4 2006b,1次GⅡ.5；從2012年10月開始到2013年初都是GⅡ.4/Sydney 2012,2013年底到2014年初5起是GⅡ.6,4次是GⅡ.3；2014年11月開始到2015年初12起都是GⅡ.17；2015年9月份開始到2016年初7起都是GⅡ.3；2016年6月份2起是GⅡ.17,9月3次是GⅡ.3；2016年11月份～12月份12起全部是GⅡ.p16-GⅡ.2。2011—2016年NV不同型別在各年份的分布見表3。

3 討論

珠海地區每年有多起NV引發的暴發疫情,僅2011年—2016年有56起,而據突發公共衛生事件管理信息系統信息(http://10.249.1.170),同期全國共報告NV胃腸炎暴發疫情340起,珠海在全國占比是16.47%,2016年全國共報告134起,而珠海地區就發生了18起,占比13.43%,作為一個地級市,珠海NV疫情的次數明顯高于其他地區,一方面可能是因為NV暴發存在一定的區域性,沿海地區更適于NV的儲存及傳播,另一方面可能是預警系統敏感,對每1起疫情都能及時響應,并經實驗室檢測后進行精準處置。2015年—2016年暴發疫情較多,與全國形勢一致。NV胃腸炎疫情高峰時段主要集中在11月份到次年的3月份,此段時間被定義為一個NV流行季［3］。突發公共衛生事件管理信息系統數據顯示,2013年—2016年全國NV流行季所發生的NV疫情占全年發生疫情的80.5%(260/323)。珠海情況亦如此,2011年—2016年期間發生56起NV疫情,只有12起不在此時間段,其他均發生在高峰期,占78.58(44/56)。

實驗結果顯示,從2011年—2016年所有暴發疫情的病例檢測均為GⅡ基因型,未發現其他型別,這與李暉等［4］學者對廣東省所做研究結果一致,自2005年以來,引起廣東省NV胃腸炎的只有諾如病毒 GⅡ群。 而在此期間,江蘇［5］、湖北［6］等地均有 GⅠ群檢出,提示南北地區差異明顯,廣東省獨特的地理位置和氣候環境造成毒株型別分布不同。

序列分析發現,在全世界范圍內廣泛流行的GⅡ.4/2006b基因型在2011—2012流行季流行,到2012年底就被替換為變異株GⅡ.4/Sydney—2012,經短時間流行后,GⅡ.4及其變異株于2013年2月至 2016 年底未再出現,唐震［5］、李靜［6］等的研究都存在GⅡ.4型,說明GⅡ.4型可能僅在廣東地區低流行,其他地區仍有流行。GⅡ.17是2014—2015流行季珠海流行的唯一型別,到2015年9月才有GⅡ.3出現,GⅡ.17與GⅡ.3交替出現,直到2016年9月,完全被GⅡ.17主導,據報道GⅡ.17基因型在日本,韓國、澳大利亞、中國臺灣、廣東、江蘇、上海、湖北等地都有發現,并在此段時間成為優勢株［7-12］。到了2016年底,一個新的重組株出現并替代了GⅡ.17,并在此時間段成為唯一型別。11月21日發生第1次暴發疫情,接著在下面的一個月連續發生了11次由GⅡ.p16-GⅡ.2引發的疫情,且暴發地點均為幼兒園和小學,與其他地區報道的此型病毒感染人群一致［13-15］,提示GⅡ.p16-GⅡ.2主要引起兒童感染。同時,在廣東省多地以及德國、日本、中國臺灣等地相繼出現GⅡ.p16-GⅡ.2的報道［14］,顯示該型NV已經在世界范圍內流行。

表3 2011—2016年諾如病毒基因型分布表Tab.3 Distribution of genotypes of NV during 2011-2016

圖1 諾如病毒的N/S區域遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of N/S regions of NV

GⅡ.p16-GⅡ.2作為新出現的重組株,基因進化樹顯示,中國香港的 KY817739,中國臺灣的KY457733、俄羅斯的 KY210921,以及江蘇的MF167652遺傳距離很近。GⅡ.P16/GⅡ.2 NV的出現和傳播的具體機制尚不明確,諾如病毒ORF1/ORF2重疊交界區發生型間或型內重組的幾率較大,重組是病毒進化的主要機制之一,通過重組導致病毒毒力、易感性、環境耐受性等方面的變化,GⅡ.p16目前已報道的重組株包括:GⅡ.p16/GⅡ.16、GⅡ.p16/GⅡ.17、GⅡ.p16/GⅡ.2、GⅡ.p16/GⅡ.6、GⅡ.p16/GⅡ.4［15］,提示今后監測中應加強 RdRp和衣殼蛋白檢測,密切關注該重組NV的流行和進化,警惕引起全球性NV暴發流行的可能。

利益沖突:無