尿素包合法富集壓榨松籽油中皮諾斂酸工藝優化

劉志鑫 劉志彬 張根生 岳曉霞 楊慧鐸 許春明

(哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

皮諾斂酸是松籽油中獨有的一種十八碳三烯酸[1]，分子式為C18H30O2[2]，與其他的不飽和脂肪酸不同，它只存在于松籽油中[3]。近年來，肥胖人群逐漸增多，一般的減脂產品都有抑制神經中樞等副作用[4]，而皮諾斂酸不僅能夠降低體重，還能抑制、消除其他不飽和脂肪酸對機體的不利影響，同時還具有抗炎、解熱、鎮痛，對抗各種真菌、病毒感染，促進中老年人排泄功能等作用[5]。對升高高密度脂蛋白膽固醇水平、降低低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯和血糖水平的作用更是顯著[6]。中國東北地區松籽資源豐富，但大量的松籽都出口國外[7]，國內市場上也罕見以松籽為原料的保健食品。

國內外研究人員關于不飽和脂肪酸提取的研究方法主要包括尿素包合法[8]、低溫結晶法[9]、分子蒸餾法[10]、精餾分離法[11]、吸附分離法[12]、脂肪酶濃縮法[13]、超臨界流體萃取法[14]等。尿素包合法相對于其他方法具有設備簡單、操作簡便、價格低廉等優點[15]，適合工廠進行大規模的富集生產。現有利用尿素包合法提取不飽和脂肪酸的研究對象也主要集中在植物油類[16]、魚油類[17]和EPA/DHA等脂肪酸[18]，而對皮諾斂酸提取的研究則相對較少。為數不多的關于松籽油和皮諾斂酸的研究主要集中在脂肪酸成分分析及其功能性上，對提取條件并未深化研究，Lee等[19]在試驗中對皮諾斂酸進行一次尿素包合，尿素包合后皮諾斂酸質量分數由14.1%提高到45.1%，將皮諾斂酸的質量分數提高了近3倍。楊明非等[20]利用尿素包合法對脂肪酸進行一次包合后，皮諾斂酸質量分數提高到45.8%。

壓榨松籽油中不飽和脂肪酸含量較高，品質較好，營養成分未被破壞，且酸、堿、重金屬、膽固醇等殘留較少。本研究擬以壓榨松籽油為原料，利用尿素包合法對皮諾斂酸進行多次包合試驗，在單因素基礎上對其富集條件進行優化，旨在為松籽的開發利用和提高松籽產品的附加值提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

壓榨松籽油：黑龍江宏泰松果有限公司；

尿素：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；

正庚烷：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

三氟化硼甲醇溶液：14%，上海源葉生物科技有限公司；

鹽酸、甲醇、乙醇、氯仿：分析純，西隴化工股份有限公司；

皮諾斂酸甲酯標準品：≥98%，Cayman Chemical Company；

氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：BS224S型，塞多利斯貿易有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98-1型，天津市泰斯特儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：R-205型，上海申勝生物技術有限公司；

循環水式多用真空泵：SHB-IV雙A型，鄭州長城科工貿有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：CI-200型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

氣相色譜儀：GC7900型，上海天美科學儀器有限公司；

高純氫發生器：SGH-300型，北京東方京華苑科技有限公司；

低噪音空氣泵：SGK-2LB型，北京東方京華苑科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 游離脂肪酸的制備 根據文獻[21]，修改如下：配制200 mL濃度為0.6 mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液，向溶液中加入30 g松籽油，在80 ℃條件下加熱回流并進行磁力攪拌，45 min 后冷卻至5 ℃并在此條件下放置，1 h后將溶液中的不皂化物抽濾除去。旋轉蒸發乙醇，加入100 mL蒸餾水，用6 mol/L的鹽酸將其pH調至2，旋轉蒸發出殘留的溶劑，即得到游離脂肪酸。

1.2.2 尿素包合條件 將3 g脂肪酸加入到不同比例的尿素乙醇溶液中，在75 ℃條件下水浴至尿素完全溶解，冷卻后在設定的溫度和時間下放置。經抽濾回收乙醇后加入15 mL 蒸餾水，鹽酸酸化后加10 mL三氯甲烷萃取，得到濃縮的多不飽和脂肪酸。

1.2.3 脂肪酸甲酯的制備 按GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》規定的方法制備。

1.2.4 氣相色譜分析條件 色譜條件為：Capillary 30 m×0.25 mm×0.33 μm，程序升溫條件：初始溫度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升至220 ℃，保持17 min。FID檢測器，檢測器和進樣口溫度250 ℃，進樣量0.4 μL，N2流速15 cm/s，空氣流速450 mL/min，H2流速40 mL/min，尾吹流量30 mL/min。

1.2.5 皮諾斂酸含量和損失率的測定 皮諾斂酸含量的測定按GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》規定的方法測定，按面積歸一化法進行計算。皮諾斂酸的含量測定后，其損失率按式(1)計算：

(1)

式中：

R——皮諾斂酸的損失率，%；

m原——原料中皮諾斂酸的質量，g；

m包——尿素包合后皮諾斂酸的質量，g。

1.2.6 綜合評分 運用隸屬度綜合評分法以皮諾斂酸含量、損失率為指標，對尿素包合工藝進行綜合評分[22]，皮諾斂酸含量隸屬度按式(2)計算，因為損失率越小越好，所以隸屬度按式(3)計算：

(2)

(3)

式中：

l1——皮諾斂酸含量的隸屬度；

l2——皮諾斂酸損失率的隸屬度；

ci——指標值；

cmin——指標值最小值；

cmax——指標值最大值。

考慮到以皮諾斂酸含量為主要指標，損失率為次要指標，于是取權值分別為0.8，0.2，綜合評分按式(4)計算：

S=al1+bl2，

(4)

式中：

S——綜合分；

a——皮諾斂酸含量的權值；

b——皮諾斂酸損失率的權值。

1.2.7 尿素包合法富集皮諾斂酸的單因素試驗設計

(1) 脂肪酸∶尿素對皮諾斂酸含量和損失率的影響：按脂肪酸與乙醇比為1∶8 (g/mL)，乙醇濃度95%，結晶溫度5 ℃，結晶時間24 h。改變不同的脂肪酸∶尿素比率[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/g)]測定皮諾斂酸含量和損失率的變化。

(2) 脂肪酸∶乙醇對皮諾斂酸含量和損失率的影響：脂肪酸與尿素比為1∶3 (g/g)，乙醇濃度95%，結晶溫度5 ℃，結晶時間24 h。改變不同的脂肪酸∶乙醇比率[1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10 (g/mL)]測定皮諾斂酸含量和損失率的變化。

(3) 結晶溫度對皮諾斂酸含量和損失率的影響：脂肪酸與乙醇比為1∶8 (g/mL),脂肪酸∶尿素為1∶3 (g/g)，乙醇濃度95%，結晶時間24 h。改變不同的結晶溫度(-25，-15，-5，5，15 ℃)測定皮諾斂酸含量和損失率的變化。

(4) 結晶時間對皮諾斂酸含量和損失率的影響：脂肪酸與乙醇比為1∶8 (g/mL)，脂肪酸∶尿素為1∶3 (g/g)，乙醇濃度95%，結晶溫度5 ℃，改變不同的結晶時間(12，18，24，30，36 h)測定皮諾斂酸含量和損失率的變化。

1.2.8 包合次數對皮諾斂酸含量和損失率的影響 在最優的尿素包合條件下，對皮諾斂酸進行多次包合，通過測定皮諾斂酸含量和損失率的變化，得到最佳包合次數。

1.2.9 尿素包合法工藝參數優化 根據單因素試驗結果，采用響應曲面法，考察尿素與脂肪酸比、乙醇與脂肪酸比、包合溫度、包合時間4個因素對皮諾斂酸含量和損失率的影響。

1.2.10 數據處理方法 每個檢測指標重復測定3次，采用SPSS 17.0、Excel 2007、Design-Expert 8.0.6等統計分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 脂肪酸、尿素比對皮諾斂酸含量和損失率的影響 由圖1可知：隨著尿素量的增加，皮諾斂酸含量呈現先升高后降低的趨勢，與郭瑩瑩等[16]富集文冠果油中神經酸結果相似。原因是隨著尿素的增加，包合結晶物增加，包合效果更加完全，皮諾斂酸含量達到最大；而尿素過量添加，會阻礙包合晶體生長，使其含量呈平緩降低的趨勢。隨著尿素量的增加，使得晶體在包合其他脂肪酸的同時，對皮諾斂酸的攜帶和吸附也有所增加，導致皮諾斂酸損失率逐漸增大。因此，由皮諾斂酸含量和損失率綜合考慮，脂肪酸∶尿素最適宜配比為1∶3 (g/g)。

圖1 脂肪酸∶尿素對皮諾斂酸含量和損失率的影響Figure 1 Effect of fatty acids∶urea on the content and loss rate of pinolenic acid

2.1.2 脂肪酸、乙醇比對皮諾斂酸含量和損失率的影響 由圖2可知，隨著乙醇量的增加，皮諾斂酸含量呈現先升高后降低的趨勢。原因是隨著乙醇的增加，尿素溶解量增大，包合向正反應方向進行，包合效果逐漸變好；而過量的乙醇則導致尿素比例減少，部分脂肪酸溶于乙醇中，使皮諾斂酸含量降低。隨著乙醇的增加，皮諾斂酸損失率呈波動性變化，張彧等[21]認為乙醇在包合過程中只起到溶劑的作用，對皮諾斂酸的損失率影響較小。因此，綜合皮諾斂酸含量和皮諾斂酸損失率考慮，脂肪酸∶乙醇最適宜配比為1∶8 (g/mL)。

2.1.3 結晶溫度對皮諾斂酸含量和損失率的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，皮諾斂酸的含量呈現先升高后降低的趨勢，與閔征橋等[8]富集魚油中EPA和DHA的研究結果相似。原因是在包合溫度較低時，形成的包合結晶物較快，晶核來不及長大，形成的晶體較小；當包合溫度過高時，形成的晶體較為粗糙，對脂肪酸包合不牢固，從而使其含量降低。隨著溫度的升高，皮諾斂酸損失率呈逐漸下降趨勢，原因是溫度越低，形成晶體越快，溶劑和尿包物一起凝固，使抽濾難度增大，皮諾斂酸損失率較高。因此，綜合皮諾斂酸含量和皮諾斂酸損失率考慮，尿素包合過程中最佳包合溫度為5 ℃。

圖2 脂肪酸∶乙醇對皮諾斂酸含量和損失率的影響Figure 2 Effect of fatty acids∶ethanol on the content and loss rate of pinolenic acid

圖3 包合溫度對皮諾斂酸含量和損失率的影響Figure 3 Effect of inclusion temperature on the content and loss rate of pinolenic acid

2.1.4 包合時間對皮諾斂酸含量和損失率的影響 由圖4可知，隨著包合時間的延長，皮諾斂酸含量呈現先升高后緩慢降低的趨勢。原因是隨著包合時間的延長，形成的包合結晶物緩慢增多，包合效果向正反應方向進行，當包合時間為24 h時，反應達到平衡；但隨著包合時間繼續延長，包合晶體逐漸增多，對皮諾斂酸的攜帶和吸附也增多，導致了皮諾斂酸含量的降低和損失率的增加[21]。因此，綜合皮諾斂酸含量和皮諾斂酸損失率考慮，尿素包合過程中最適宜尿素包合時間為24 h。

圖4 包合時間對皮諾斂酸含量和損失率的影響Figure 4 Effect of inclusion time on the content and loss rate of pinolenic acid

2.1.5 包合次數對皮諾斂酸含量和損失率的影響 由圖5可知，隨著包合次數的增加，皮諾斂酸含量呈現先升高后緩慢降低的趨勢，皮諾斂酸損失率則呈現逐漸升高的趨勢。當包合2次時，尿素晶體將殘余的未包合的單不飽和脂肪酸和部分多不飽和脂肪酸進行進一步包合，使得皮諾斂酸含量有了顯著的提高；包合3次時，殘余的未包合的脂肪酸較少，所以皮諾斂酸含量略微有所提高，但皮諾斂酸損失率有明顯的增加；包合4次時，由于經過多次包合步驟，在其他脂肪酸被包合的同時部分皮諾斂酸也被帶走，使皮諾斂酸含量有所下降，損失率有所增加。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量和損失率，最適宜包合次數為2次，該條件下皮諾斂酸含量可提高到53.26%。

2.2 尿素包合試驗響應面結果及分析

根據上述單因素試驗結果，確定尿素包合時間、包合溫度、脂肪酸與尿素比、乙醇與尿素比的各項參數水平(表1)。采用Box-Behnken設計對尿素包合工藝進行優化，結果見表2。

圖5 包合次數對皮諾斂酸含量和損失率的影響Figure 5 Effect of inclusion times on the content and loss rate of pinolenic acid表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

水平A 尿素︰脂肪酸(g/g)B 乙醇︰脂肪酸(mL/g)C 包合溫度/℃D 包合時間/h-127-5180385241491530

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.1 綜合分的回歸方程及方差分析 利用Design-Expert 8.06分析軟件對表2數據進行分析得到二元多項式回歸方程：

S= 0.93+0.08A+0.038B-0.1C+0.018D-2.5×10-5AB+0.023AD+0.039BC-0.35A2-0.24B2-0.19C2-0.23D2。

(5)

通過方差分析(P>0.05)，在剔除了不顯著因素AB和AD后，得到新的回歸方程：

S= 0.93+0.08A+0.038B-0.1C+0.018D+0.039BC-0.35A2-0.24B2-0.19C2-0.23D2。

(6)

2.2.2 響應面結果分析 由圖6(a)可知，曲面較為陡峭，說明包合溫度和乙醇與脂肪酸比對綜合分的影響較大。由圖6(b)可知，等高線為橢圓形，說明包合溫度和乙醇與脂肪酸比交互作用較為顯著。

2.2.3 驗證實驗結果與分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件，通過設定綜合分取最大值，對包合工藝進行優化，得到脂肪酸∶尿素為1∶2.88 (g/g)，脂肪酸∶乙醇為1∶7.98 (g/mL)，包合時間23.44 h，包合溫度4.18 ℃，在此條件下皮諾斂酸含量為53.21%，皮諾斂酸損失率為17.49%，綜合分值為0.900 6。為進一步驗證回歸方程的準確性和有效性，考慮到實際操作的方便，設置參數[脂肪酸∶尿素=1∶3 (g/g)，脂肪酸∶乙醇=1∶8 (g/mL)，包合時間24 h，包合溫度4 ℃]進行驗證實驗，得到皮諾斂酸含量為53.36%，皮諾斂酸損失率為17.24%，綜合分值為0.954 3，可見回歸模型能很好地預測綜合分，優化結果可靠。圖7(a) 為松籽油氣相檢測圖譜，圖7(b) 為最佳包合條件下脂肪酸氣相檢測圖譜，皮諾斂酸出峰時間為22.537 min，證明了尿素對其他脂肪酸的包合作用。

表3 回歸方程系數及顯著性檢驗結果?Table 3 Analysis results of significance test of the regression coefficients

圖6 包合溫度和乙醇與脂肪酸比對包合對工藝綜合評分S的影響Figure 6 Influence of inclusion temperature and ratio of ethanol to fatty acid on process comprehensive score (S)

圖7 氣相檢測圖譜Figure 7 Gas chromatograph

3 結論

本試驗在脂肪酸∶尿素=1∶2.88 (g/g)，脂肪酸∶乙醇=1∶7.98 (g/mL)，包合時間23.44 h，包合溫度4.18 ℃的最優工藝條件下，將皮諾斂酸含量由一次包合的39.27%提高到了53.36%，證明多次包合對包合效果具有顯著作用。通過響應面組合設計得出綜合分的二次多項式回歸模型，經過驗證實驗證明了模型的合理可靠性。尿素包合法是利用脂肪酸不飽和程度對其進行富集，可將尿素包合法與其他方法相結合，進一步提高皮諾斂酸含量。