海洋微生物的分離與拮抗菌株的初篩

胡秀榮 黃振東 蒲占湑 杜丹超 陳國(guó)慶 鹿連明

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州318026）

柑橘黑點(diǎn)病在浙江柑橘產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是當(dāng)前柑橘重點(diǎn)防治的對(duì)象。目前生產(chǎn)上防治黑點(diǎn)病主要以代森錳鋅為主，一年噴藥4～5次，由于該藥劑多年連續(xù)使用，再加上農(nóng)戶噴藥過(guò)程中經(jīng)常隨意加大用藥濃度，勢(shì)必造成農(nóng)藥的殘留和環(huán)境的污染，因而開(kāi)發(fā)低殘留、對(duì)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥很有必要，本研究試圖從浙江大陳島海域采樣分離微生物，從中篩選出具有拮抗活性的菌株，為開(kāi)發(fā)新的生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海洋微生物的分離

1.1.1 樣品的采集。為排除陸地微生物的干擾，從遠(yuǎn)離大陸的大陳島（下大陳島）周邊海域取樣，樣品包括新出海的魚(yú)類、貝類、蝦類以及潮間帶的泥沙，將采集的樣品放入裝有冰塊的保溫箱，24h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行微生物的分離[1]。

1.1.2 分離培養(yǎng)基。共選用5種分離培養(yǎng)基，成分如下：G1：可溶性淀粉20g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，人工海水1000ml；M1：葡 萄 糖10g；天 冬 氨 酸0.5g；K2HPO40.5g；MgSO4·7H2O0.05g；瓊脂20g；人工海水1000ml；M2：瓊脂20g；人工海水1000ml；PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，人工海水1000ml；NA：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，瓊脂20g，人工海水1000ml。

其中人工海水是采用Sigma 公司生產(chǎn)的海鹽40g加入1000ml 的純凈水溶解而成。G1、M1和M2三種培養(yǎng)基中均加入萘啶酮酸15μg/ml、制霉菌素50μg/ml和放線菌酮50μg/ml[3]。

1.1.3 海洋微生物的分離與培養(yǎng)。將采集魚(yú)類、貝類和蝦類的樣品用無(wú)菌剪刀剪碎，取1g樣品，放入4ml的無(wú)菌水中，55℃熱激10min，劇烈搖動(dòng)，再將樣品1:4稀釋，取20μL 稀釋液均勻涂布于5種分離培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～6周，待菌落長(zhǎng)出，挑取菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，純化培養(yǎng)的菌株再接種到含分離培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹2]。……