抗酸桿菌自動熒光染色和顯微鏡掃描技術在結核病診斷中的臨床評價

李強 楊紅國 鄧云峰 歐喜超 夏輝 趙雁林

結核病是全球范圍內傳染病的第二大死亡原因，仍是全球主要的公共衛生問題；根據世界衛生組織的報告，近3年來全球結核病患者從900萬例上升到1040萬例；中國是結核病高負擔國家，每年約有100萬例患者被診斷為結核病[1]。肺結核及時準確的診斷可迅速啟動治療，減少社區傳播。

抗酸桿菌(AFB)痰涂片顯微鏡鏡檢仍是中低收入國家結核病診斷的重要方法。在中國，近3000個縣級實驗室使用顯微鏡檢查診斷肺結核[2]。然而，傳統的顯微鏡依賴于人工檢查，檢測的敏感度差異較大[3]。1名熟練的技術人員對1份標本要花費至少5 min來檢查顯微鏡下萋-尼染色涂片的300個視野。此外，技術人員在閱讀幾張涂片后通常很容易產生視覺疲勞。為保證顯微鏡檢查的質量，1名工作人員不能連續檢查25張涂片[4]。熒光顯微鏡檢查(FM)鏡下視野小，僅需要檢查50個視野，可以縮短閱片時間。因此，FM在工作量大的實驗室得到廣泛應用，以減輕實驗室工作人員的工作強度。此外，FM較萋-尼染色顯微鏡檢查的敏感度高[5]。

在過去的20年中，許多科學家致力于開發自動顯微鏡閱讀系統，以加快閱片時間，減少其對技術人員的依賴[6-7]。基于圖像分析的自動顯微鏡檢查技術取得一定的進步[8]，其步驟通常包括自動聚焦、圖像捕獲、圖像分割和對象分類[9]。自動熒光染色和顯微鏡掃描技術(AFSS)由自動染色機和自動掃描顯微鏡系統組成(上海皓信)。顯微鏡受計算機控制，由電動機驅動。該系統有4種類型的模塊，包括單片機和多片機，可供不同工作量實驗室選擇。AFSS掃描每個涂片需要2 min。每一個包含AFB的視野將被保存用于人工復核。在數據庫分析的基礎上，計算機通過掃描涂片視野，給實驗人員展示一個陽性或陰性結果的典型圖像。為了解AFSS 在地市級醫院的臨床表現，筆者在臨沂市人民醫院開展了本項研究。

材料和方法

1.標本來源：2016年9—12月，連續納入臨沂市人民醫院門診就診的748例肺結核可疑癥狀者。747例留取3份痰標本，1例留取2份痰標本，共計有2243份標本用于本次研究的實驗室檢查。

2.涂片檢查：每一份痰標本制作2張涂片， 1張用于傳統熒光染色顯微鏡檢查， 采用40×物鏡。分級標準如下：陰性 (0條AFB/50 視野)； 實際條數 (1～9 條AFB/50 視野)； + (10～49條 AFB/50視野)； ++(1～9條 AFB/視野)；+++(10～99條 AFB/視野)；++++ (≥100 條AFB/視野)[10]。

3.自動染色涂片掃描：同時采用另外1張涂片進行AFSS自動染色和顯微鏡掃描。

4.培養：每份痰標本取2 ml痰液用4% NaOH按照 1∶1體積比例混合消化15 min，每個羅氏固體培養基接種0.1 ml，37 ℃恒溫培養箱培養8周[11]。9份樣本羅氏固體培養發生污染，共計2234份樣本獲得培養結果。

5.質量控制：為保證質量，每個技術人員在項目研究開始前參加統一技術培訓，培訓后開展1周現場預實驗。預實驗期間，所有痰涂片需由1位工作人員應用萋-尼染色法復核[10]。研究現場實驗室平時常規接受上級實驗室進行的質量控制檢查。

6.統計學處理：所有數據錄入Excel表格，數據分析使用SPSS 22.0統計學軟件，不同方法檢出率的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

結 果

一、 AFSS和傳統FM陽性率分析

AFSS檢測陽性率為32.1%，略高于傳統FM顯微鏡檢查31.9%陽性率，但差異無統計學意義 (P>0.05) ，見表1。

二、AFSS和傳統FM檢測結果對比分析

AFSS和傳統FM檢測總體一致率為97.1%(2177/2243)，66份樣本檢測結果有差異。 31份樣本傳統FM檢測為陽性而AFSS檢測為陰性，占AFSS檢測陰性的2.0% (31/1523)， 其中，5份樣本傳統FM檢測結果為高陽性級別 (+++和++++)。35份樣本AFSS檢測陽性而傳統FM檢測為陰性，約占傳統FM檢測陰性的2.3% (35/1527)，其中，91.4% (32/35) 的樣本AFSS檢測結果為低陽性級別 (實際條數和+)，見表2。

三、AFSS及傳統FM檢測不一致者與培養結果的比較分析

與培養結果相比較，AFSS檢測陰性而傳統FM檢測陽性的樣本中， 96.8% (30/31) 培養陽性；AFSS檢測陽性而傳統FM檢測陰性的樣本中，54.3% (19/35) 培養陽性(表3)。AFSS檢測陽性而傳統FM檢測陰性且培養陽性的16份樣本， AFSS 檢測結果均為低陽性級別(實際條數和+)，其中4份樣本萋-尼染色復核鏡檢結果為陽性。

表1 2243份痰標本采用AFSS和傳統FM檢測的陽性率比較

表2 AFSS和傳統FM檢測結果對比分析 (份)

表3 AFSS及傳統FM檢測不一致者與培養結果的比較分析 (份)

注a：AFSS檢查有6 份標本檢測結果為實際條數，9份為+，1份為++；b： FM檢查有4 份為+++，1 份為++++

表4 以羅氏固體培養為標準，AFSS和傳統FM檢測分枝桿菌的效能分析

注表中括號內數值為“95%CI值”。以痰培養(羅氏固體培養)為標準，分別計算AFSS、傳統FM檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。計算公式如下：敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%；一致率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+假陰性數+真陰性數+假陽性數)×100%，陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%

4. AFSS和傳統FM檢測分枝桿菌的效能分析

與固體培養為標準，AFSS檢測分枝桿菌的敏感度和特異度分別為83.4%和95.9%，陽性預測值和陰性預測值分別為91.6%和91.4%。60份AFSS 陽性而培養陰性的樣本中，46份樣本萋-尼染色陽性。131份AFSS陰性而培養陽性樣本中，46份樣本萋-尼染色陽性。傳統FM檢測分枝桿菌的敏感度和特異度分別為84.8%和96.9%。45份傳統FM陽性而培養陰性樣本中，43份樣本萋-尼染色結果為陽性。120份傳統FM檢測陰性而培養陽性樣本中，29份樣本萋-尼染色結果為陽性，AFSS 和傳統FM效能分析見表4。

討 論

研究報道，熒光染色顯微鏡鏡檢的敏感度高于萋-尼染色鏡檢方法[12]。2011年，世界衛生組織推薦LED熒光顯微鏡檢查可用于替代傳統萋-尼染色方法[13]。本研究結果顯示，傳統熒光顯微鏡檢查陽性率為31.9%；AFSS陽性率(32.1%)略高于傳統熒光顯微鏡檢查，但差異沒有統計學意義 (P>0.05)。AFSS和傳統熒光顯微鏡檢查總體一致率為 97.1%，盡管傳統熒光顯微鏡檢查可以檢出更多高陽性級別樣本，但AFSS可以檢測出更多的低陽性級別樣本。

本次研究中，AFSS和傳統熒光顯微鏡檢查共有66份樣本檢測結果不一致，占總樣本量的2.9%。35份傳統熒光顯微鏡檢查陰性樣本AFSS檢測為陽性，占傳統熒光顯微鏡檢查陰性結果的2.3%。這些樣本中，90%以上樣本AFSS檢測結果為+或實際條數，54.3%的樣本最終培養結果為陽性。另外31份AFSS陰性樣本傳統熒光顯微鏡檢查為陽性，這些樣本幾乎全部培養陽性。不同檢測方法產生不一致檢測結果可能有幾個方面原因：首先，臨床上收集的痰標本性狀不均勻，制作涂片時，僅取少量痰樣本，容易導致取樣差異。因此，痰涂片制作過程中取樣差異是造成檢測結果不一致的最主要原因。其次，與涂片顯微鏡不同，固體培養的關鍵問題是樣品中存在活細菌。相反，細菌的活力對涂片鏡檢的結果沒有影響。最后，不同檢測方法檢測原理不同，可能也是導致檢測結果不一致的原因。

作為一種篩查工具，特異度較敏感度更為重要，可避免漏診可疑患者。本研究結果顯示，AFSS特異度為95.9%，高于其他研究報道的自動化檢測系統[14]。131份AFSS檢測陰性樣本培養為陽性，其中46份樣本萋-尼染色復核為陽性。120份傳統熒光顯微鏡檢查陰性樣本培養為陽性，其中29份樣本萋-尼染色復核為陽性。此外，60份AFSS檢測陽性樣本培養結果為陰性，45份傳統熒光顯微鏡檢查陽性樣本培養為陰性。AFSS陰性預測值為91.4%，可能會漏掉8.6%的培養陽性樣本；而傳統熒光顯微鏡檢查陰性預測值為92.1%，可能會漏掉7.9%的培養陽性樣本。結果提示，AFSS可能會漏掉一些肺結核患者，檢測技術需要做進一步改進。盡管AFSS檢測技術和傳統FM檢測的陽性率差異無統計學意義，但AFSS是自動化檢測技術，能夠節省更多的實驗室人員去開展其他工作，可以提高臨床實驗室的工作效率。

本研究結果表明，AFSS檢測的陽性率及檢測效能等效于傳統FM檢測技術，在工作量大的實驗室、特別是人員缺乏的實驗室，AFSS檢測技術可以作為傳統FM檢查的替代工具。

志謝臨沂市人民醫院實驗室技術人員及相關部門人員在患者納入、實驗室檢測和數據錄入方面進行了大量工作。