診治山羊口瘡病例

毛從劍，張煥容，張興民

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041)

羊口瘡是由羊口瘡病毒引起的以患羊口唇、口角、鼻、乳房等部位皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結成疣狀厚痂為特征的傳染病。各年齡段的羊均能感染發病，山羊比綿羊易感，其中羔羊最易感，并常為群發性流行。該病一年四季均可發生，無明顯的季節性，但多發于初春或春末夏初。截止到2014年，我國有24個省份報道過羊口瘡病例的發生，且從2000年起，該病的報道逐年遞增[1]，說明在我國養羊業中該病的發生及對該病的關注越來越多。該病發病嚴重時會導致患病羊進食困難、營養攝入不足而生長緩慢甚至死亡，造成嚴重的經濟損失。2017 年 4 月，成都某山羊養殖場出現羔羊口瘡疫情，主訴：該群母羊未免疫口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗。該口瘡病例診治情況報告如下。

1 發病情況

2017年4月，成都某山羊養殖場2周齡左右的哺乳羔羊先后出現不同程度的唇部、嘴角部及舌面紅腫、生瘡、疣狀增生、部分病羊患部后期結痂后緩慢恢復健康，該病采用抗生素于患病部位局部注射或涂擦治療無明顯效果，羊只發病率較高，但較少死亡。

2 臨床及剖檢病變

臨床可見病羊的唇部、嘴角部及口腔內側壁及舌部生瘡、進一步發展口唇部疣狀增生(見中插彩版圖1)，發病后期口瘡結痂(見中插彩版圖2)，頸前淋巴結化膿、腫大，其他臟器無明顯病變。

3 實驗室診斷

3.1 病料采集及處理 無菌采取羔羊口唇及口腔病變組織。取病變組織用無菌PBS漂洗3次后剪碎研磨，按1∶3 (W/V)加入無菌PBS制成混懸液，置-80 ℃凍融3次后加入終濃度為2 000 U/mL的雙抗，4 ℃過夜，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液分裝至離心管，置-80 ℃備用。

3.2 病毒分離培養情況 MDBK細胞鋪滿至瓶底的80%左右時，將培養液棄去，用Hank′s洗滌1～3次，加入1.5 mL處理保存的病毒液，在37 ℃，5%CO2條件下感作1 h左右，棄去瓶內液體，加入含1%雙抗和1%犢牛血清的DMEM細胞維持液繼續培養，并逐日觀察細胞，同時設正常細胞對照。連續盲傳至第5代時，出現細胞病變，表現為細胞變圓、聚積、脫落；連續傳代至第10代，細胞病變穩定出現在接毒后96 h。

3.3 核酸提取及PCR檢測結果 用酚-氯仿法提取病變組織及細胞培養總DNA作為模板，PCR擴增檢測羊口瘡病毒B2L基因片段。采用文獻[2]的引物序列如下：上游5′-CAC GGC CAC GAA CTT CCA CCT CAA-3′，下游5′-TCC CGC TCG AAG ACC GCA GAC AG-3′；預期目的片段大小為540 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為：PremixTaq12.5 μL，模板DNA 2. 0 μL，上下游引物各1. 0 μL，加ddH2O補足至總體積25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，并將PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果經Blast序列比對后，確定擴增片段為羊口瘡病毒的B2L基因片段，表明從發病羊口唇部病變組織和細胞培養物中均能擴增出特異性的羊口瘡病毒B2L基因片段。

4 診斷結果

根據發病情況、臨床癥狀、剖檢病變和羊口瘡病毒B2L基因片段擴增結果，確診該養殖場發生羊口瘡病例。

圖3 MDBK正常對照細胞 (10×)

圖4 MDBK產生細胞病變細胞 (10×)

圖5 PCR電泳圖

5 感染血清制備及應用

5.1 感染血清制備 對發生口瘡2周齡以上的病羊無菌采取頸靜脈血，將血液放入離心管中，待血液凝固后5 000 r/min離心10 min，吸出血清裝至離心管中，加入終濃度為0.01%硫柳汞，置-80 ℃保存備用。

5.2 感染血清的應用 將制備好的感染血清用于剛發病的羔羊，每只羔羊口唇部肌肉注射1 mL，間隔兩天再注射1次，同時配合抗生素治療，結果初發口瘡的病羔羊病情得到有效控制，一般在康復血清治療后1周左右完全恢復健康。

6 討論

根據病羊的典型臨床癥狀，初步診斷為羊口瘡病例，為了確診，從具有典型羊口瘡臨床癥狀的發病黑山羊口唇部及口腔病變組織采集病料，用MDBK細胞作為病毒增殖細胞，盲傳至第5代時出現特征性細胞病變，病變細胞出現變圓、聚集、拉網、脫落現象，與殷震[3]等描述的羊口瘡病毒致細胞病變特征基本一致，并在羊口唇部及口腔病變組織、細胞培養液中檢測到了羊口瘡病毒特異性B2L基因片段，確診該起病例為羊口瘡病毒感染所導致。

近年來我國山羊口瘡發病率不斷上升，且羔羊

發生羊口瘡的日齡越來越小，1周齡內羔羊發生口瘡的現象越來越多，在此情況下，疫苗接種新生羔羊來不及起到有效保護作用，因此，只有通過母源抗體讓羔羊出生后就能獲得被動免疫保護。有研究表明，在孕羊產前接種羊口瘡滅活疫苗2～3次，對新生羔羊有很好的保護效果[4-5]。本次山羊羔口瘡疫情連續發生，持續1月以上，是由于該群母羊沒有接種口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗，通過采用先期發病后至少兩周的病羊血清治療后期初發病的羔羊，對初發口瘡病羔羊的病情得到了有效的控制，證明特異性的感染血清可用于初發口瘡病羔羊的緊急救治[6]，特異性的抗病血清對初發口瘡的病羔的治療作用與母源抗體對后代羔羊的早期被動免疫保護作用是一致的。目前，對羊口瘡病還沒有特效治療藥物，因此對羊群的免疫接種是預防該病的關鍵，本病例中畜主未對母羊進行免疫，也未對初生羔羊進行口瘡疫苗的接種，是導致該養殖場暴發羊口瘡病例的根本原因。此外羊口瘡病毒主要是由結痂病料引起的環境污染經受損的皮膚、黏膜感染機體，因此在日常管理中要注意保護羊只的皮膚、黏膜免受損傷；對羊舍、用具及周圍環境及時消毒，以減少羊口瘡病的發生。