血液腫瘤患者血漿EB病毒和巨細胞病毒定量檢測的臨床價值*

王海濱，張冬青，司英麗，趙 嬌

(中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院檢驗科，北京 100048)

EB病毒(EBV)是對人類有致癌潛能的一種γ皰疹病毒，主要侵襲人B淋巴細胞。免疫學、流行病學及分子生物學等方面研究表明，EBV感染與鼻咽癌、骨髓增生異常綜合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、伯基特淋巴瘤等多種腫瘤的發生、發展密切相關[1]。巨細胞病毒(CMV)感染可累及消化道、中樞神經系統和肺等多種器官，在血液腫瘤移植患者中，CMV的感染率高達32%～45%，病死率可達75%～90%[2-3]。因此，準確、快速診斷EBV和CMV感染的方法在早期診斷和治療中起到日益重要的作用。本研究應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)對血液腫瘤患者血漿中EBV DNA和CMV DNA的水平變化進行觀察，以探討病毒水平的動態變化與患者病毒感染的預防、診斷與治療的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月至2017年6月本院診治的280例血液腫瘤患者。患者年齡3～85歲，中位年齡41歲，其中男161例、中位年齡40歲(3～78歲)，女119例、中位年齡46歲(3～85歲)。臨床診斷為NHL 81例(28.9%),HL 27例(9.7%),急性淋巴細胞白血病(ALL)32例(11.4%),急性髓細胞白血病(AML)48例(17.1%),再生障礙性貧血(AA)43例(15.4%),多發性骨髓瘤(MM)23例(8.2%)，MDS 26例(9.3%)。所有患者經骨髓細胞形態學、細胞遺傳學和免疫學確診，符合《血液病診斷療效與標準》[4]。其中進行外周造血干細胞移植的患者126例，患者中位年齡33歲(3～77歲)，其中男81例、中位年齡32歲(5～77歲)，女45例、中位年齡33歲(3～71歲)；臨床診斷為NHL 15例(11.9%)，ALL 20例(15.9%)，AML 31例(24.6%)，AA 38例(30.1%)，MM 4例(3.2%)，MDS 18例(14.3%)。

1.2標本處理 抽取患者靜脈血2 mL，應用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，血液標本3 500 r/min離心5 min后取血漿，置于4 ℃保存，24 h內檢測完畢。

1.3實時熒光定量PCR 取100 μL血漿加入等量的DNA濃縮液充分混勻，12 000 r/min離心10 min后棄上清液，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min離心5 min后取上清液備用。EBV和CMV核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光法)均購自中山大學達安基因股份有限公司。應用實時熒光定量PCR技術檢測血漿中病毒DNA拷貝數，PCR反應體系嚴格按照產品說明書進行。應用Roche公司Light Cycler?480實時熒光定量PCR儀進行檢測，PCR反應條件為93 ℃，2 min；93 ℃，45 s，55 ℃，60 s，循環10次；93 ℃，30 s，55 ℃，45 s，循環30次，采集點選擇在55 ℃，45 s，反應體系為45 μL。每次PCR反應均設置4個標準品(拷貝數數量級為107、106、105、104，用于制作標準曲線，以EBV為例，圖1)，根據試劑盒說明書病毒DNA拷貝數>500 copy/mL定義為陽性結果。

圖1 EBV病毒DNA的PCR標準擴增曲線

注：A為4個標準品病毒DNA的PCR擴增曲線；B為病毒DNA的PCR擴增標準曲線

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1血液腫瘤患者血漿EBV和CMV檢測陽性率分布 280例血液腫瘤患者中EBV檢測陽性的患者48例，陽性率為17.1%，CMV檢測陽性的患者53例，陽性率為18.9%，動態監測病毒DNA拷貝數為102～107copy/mL，EBV和CMV檢測同時陽性者25例，陽性率為8.9%。其中AA患者中EBV和CMV檢測陽性率分別為27.9%和37.2%，見表1。

表1 血液腫瘤患者的EBV、CMV感染情況[n(%)]

2.2血液腫瘤患者中接受移植者的病毒感染情況 血液病患者中接受骨髓或外周造血干細胞移植的患者126例，其中EBV檢測陽性的患者36例，陽性率為28.6%，EBV感染拷貝數為0～5×102copy/mL，EBV感染拷貝數最高為1.81×106copy/mL；CMV檢測陽性的患者51例，陽性率為40.5%，CMV感染拷貝數為0～5×102copy/mL，CMV感染拷貝數最高為6.30×104copy/mL。EBV和CMV檢測同時陽性者25例，陽性率為19.8%。

2.3接受移植者的臨床特征及病毒感染情況 126例接受移植患者中共有36例(28.6%)發生EBV血癥，其中男性患者EBV感染率稍高于女性患者(30.9%vs.24.4%，P>0.05)，ALL患者感染率稍高于其他疾病患者(P>0.05)，異體移植發生EBV血癥的感染率為33.3%，自體移植患者并無EBV感染。所有患者中共有51例(40.5%)發生CMV血癥，其中男性患者CMV感染率稍高于女性患者(44.4%vs.33.3%，P>0.05)，ALL患者感染率稍高于其他疾病患者(P>0.05)，異體移植發生CMV血癥的感染率為47.2%，自體移植患者并無CMV感染。血液腫瘤患者接受移植者中13例患者EBV的PCR檢測連續呈陽性，36例患者CMV的PCR檢測連續呈陽性，給予更昔洛韋、阿昔洛韋、膦甲酸鈉等抗病毒治療，病毒感染進展為病毒性肺炎、腦炎、腸炎等疾病時，進行聯合抗病毒治療，同時增加免疫球蛋白以提高患者機體免疫力，患者均在抗病毒治療7～14 d后轉陰。其中有1例進行異基因造血干細胞移植后56 d出現EBV拷貝數升高，有1例進行異基因造血干細胞移植后85 d后出現EBV拷貝數升高，同時出現了移植后淋巴細胞增殖性疾病(PTLD)，發生率為1.59%(2/126)。126例血液腫瘤患者中共5例發生死亡，2例患者為多重感染導致敗血癥及呼吸衰竭，2例患者為重度移植物抗宿主病，1例患者出現移植后原發疾病復發。隨訪患者，本研究還發生的2例移植后PTLD，發生率為1.59%。見表2。

表2 126例造血干細胞移植患者的臨床特征及病毒感染情況[n(%)]

注：死亡者中有1例既有EBV感染又有CMV感染

3 討 論

血液惡性腫瘤的發病率在世界范圍內逐年遞增，嚴重危害人類健康，隨著臨床診療水平的提高，造血干細胞移植目前逐漸成為治療血液疾病的有效手段，使血液腫瘤患者造血系統和免疫系統重建，但是移植后的并發癥是影響移植成敗的關鍵因素。由于免疫重建緩慢及免疫抑制劑的應用等原因，使血液腫瘤患者容易發生經輸血及供者干細胞病毒感染，以及體內潛伏的病毒復燃[5-6]，其中EBV和CMV感染是威脅患者臨床療效和生存的重要并發癥之一。EBV和CMV的傳統血清學檢測雖然簡便快速，但是敏感性較差，無法提供患者現癥感染的臨床資料，應用實時熒光定量PCR技術檢測血漿EBV DNA和CMV DNA，比常規PCR技術靈敏度更高，能夠更為精確地反映患者EBV和CMV感染的狀態[7]。

據報道EBV人群易感性高，成人EBV血清學陽性率超過95%[8]，而成人血清CMV陽性率幾乎為100%，即大部分人都存在既往感染。移植后與EBV感染相關的PTLD是少見但是致命的并發癥[9]，單倍體移植患者移植后發生PTLD的危險性較高。本研究分析發現，移植后EBV的感染率為28.6%，男性患者EBV感染率稍高于女性患者，AA感染率高于其他疾病患者，其中PTLD的發生率為1.59%，較文獻[10]報道低。CMV感染可以累及肝、肺、消化道等，CMV相關間質性肺炎早期診斷和治療，可顯著降低其病死率。本研究發現，移植后CMV的感染率為40.5%，男性患者CMV感染率稍高于女性患者，在CMV感染的患者中出現3例間質性肺炎，AA感染率高于其他疾病患者。動態監測患者病毒DNA拷貝數為102～107copy/mL，在所有患者中，EBV和CMV檢測同時陽性者為25例，陽性率為19.8%。對PTLD高風險人群應警惕EBV感染的發生，在應用免疫抑制劑加量前應密切監測EBV DNA載量，建議定期復查EBV病毒載量，以及密切觀察相關的臨床表現。本研究發生的2例PTLD，由于臨床早期識別，并進行及時干預，減少免疫抑制劑用量，應用抗病毒藥物，患者預后良好。

綜上所述，通過實時熒光定量PCR檢測血液腫瘤患者血漿EBV DNA和CMV DNA水平有助于EBV和CMV感染的早期診斷和療效判斷，其檢測靈敏度高，穩定性強。造血干細胞移植后患者移植前后病毒的預防及感染后的抗病毒治療是非常必要而且有效的，使病毒載量降低并最終轉陰，從而可以降低病死率。因此，血漿EBV DNA和CMV DNA檢測具有重要的臨床意義。