ASB及UTI患者尿液中分離的大腸埃希菌系統(tǒng)分群、毒力基因及耐藥性分析*

鄧 聰，區(qū)靜怡，朱雪蓮，彭 亮

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510260)

尿路感染是臨床上最普遍的細(xì)菌感染之一。由于女性特殊的泌尿道解剖結(jié)構(gòu)，女性尿路感染的發(fā)生率遠(yuǎn)高于男性。40%～50%的女性一生至少經(jīng)歷過一次尿路感染。同時，尿路感染也是老年人和兒童常見的感染性疾病[1]，其致病機(jī)制至今仍不明確。根據(jù)有無臨床表現(xiàn)，尿路感染可被分為無癥狀菌尿(ASB)及癥狀性尿路感染(UTI)。ASB表現(xiàn)在泌尿系統(tǒng)中存在著持續(xù)性細(xì)菌增殖，但在臨床上無常見的“尿頻、尿急、尿痛”等尿路感染的癥狀。ASB在臨床很常見，尤其多見于妊娠女性、老年女性及糖尿病患者。健康女性ASB的發(fā)生率隨著年齡的增長而增加，新生兒發(fā)病率為1%左右而80歲的老年女性可達(dá)10%～20%[2]。大腸埃希菌是尿路感染最常見的病原菌。絕大多數(shù)ASB和UTI均由尿路致病性大腸埃希菌(UPEC)引起。雖然由同一種菌株引起，但ASB和UTI臨床表現(xiàn)卻截然不同，其具體機(jī)制至今仍不明確。本文通過對ASB和UTI患者尿液中分離的UPEC進(jìn)行系統(tǒng)分群、毒力基因和耐藥性檢測，以期發(fā)現(xiàn)決定尿路感染發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步明確UPEC致病機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年5月至2016年3月本院檢驗(yàn)科微生物室清潔中段尿細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為大腸埃希菌，且同時滿足1.2中診斷標(biāo)準(zhǔn)的菌株共145株。根據(jù)有無尿路感染的臨床表現(xiàn)分為ASB組和UTI組，其中ASB組65株，UTI組80株。65例ASB患者中男15例，女50例，年齡26～75歲，中位年齡62歲。80例UTI患者中男21例，女59例，年齡28～72歲，中位年齡51歲。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) UTI：(1)清潔中段尿細(xì)菌培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)≥105CFU/mL；(2)清潔中段尿沉渣鏡檢每高倍鏡視野白細(xì)胞數(shù)≥5個。具備以上兩項(xiàng)且同時具有典型尿路感染癥狀可確診，如不符合(2)，則再次行清潔中段尿細(xì)菌培養(yǎng)，如菌落計(jì)數(shù)仍≥105CFU/mL，且兩次為同一細(xì)菌，可以確診。ASB：連續(xù)兩次或以上清潔中段尿細(xì)菌培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)≥105CFU/mL，無全身及任何泌尿道感染癥狀，且在3個月內(nèi)未接受針對尿路感染的抗菌藥物治療。

1.3儀器與試劑 Taq DNA聚合酶、DNA標(biāo)記物均購自寶生物工程(大連)有限公司,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PCR擴(kuò)增儀和電泳儀購于美國Bio-Rad公司，凝膠圖像分析系統(tǒng)購于英國Syngene公司，藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.4方法

1.4.1系統(tǒng)分群 采取煮沸裂解法提取菌株DNA。利用多重PCR檢測大腸埃希菌分群基因ChuA、YjaA和特征性DNA片段TspE4C2.1，將大腸埃希菌分為A、B1、B2、D群。PCR引物序列見表1，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見CLERMONT等[3]的報道。

表1 PCR檢測分群基因引物序列

1.4.2毒力基因檢測 采用多重PCR方法檢測大腸埃希菌10種毒力基因表達(dá)，包括黏附相關(guān)基因afa、papA、sfa和fimH，細(xì)胞毒性相關(guān)基因sat、細(xì)胞毒性壞死因子1(cnf1)和溶血素(hlyA)，鐵攝取相關(guān)基因fyuA、irp2和iutA。PCR引物序列見表2，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見JOHNSON等[4]的報道。

表2 PCR檢測毒力基因引物序列

1.4.3藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散(K-B)法檢測ASB組和UTI組大腸埃希菌對18種抗菌藥物的敏感性，根據(jù)2014年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S22文件標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物敏感或耐藥。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測按CLSI推薦的雙紙片擴(kuò)散法進(jìn)行確證。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1系統(tǒng)分群 系統(tǒng)分群結(jié)果顯示，ASB組中，B2群(43.07%)菌株最多，其次是B1群(38.47%)、A群(10.77%)和D群(7.69%)。而在UTI組中，B2群(62.50%)菌株占絕大多數(shù)，其余分別為D群(15.00%)、A群(12.50%)、B1群(10.00%)。兩組系統(tǒng)分群結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.005,P<0.05)。見表3。

表3 ASB組和UTI組大腸埃希菌系統(tǒng)分群[n(%)]

2.2毒力基因表達(dá)檢測 黏附相關(guān)基因中，fimH在兩組中表達(dá)率最高，4種黏附相關(guān)基因在ASB組中的表達(dá)率均高于UTI組，其中afa、sfa基因表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞毒性相關(guān)基因的表達(dá)率，UTI組高于ASB組，其中cnf1和hlyA基因的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)，UTI組同樣高于ASB組，其中fyuA和iutA基因的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 ASB組和UTI組大腸埃希菌毒力基因表達(dá)檢測[n(%)]

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 ASB組和UTI組大腸埃希菌對除亞胺培南以外的17種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度耐藥，其中對呋喃妥因耐藥率較低，耐藥率最高為氨芐西林。兩組大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率及產(chǎn)ESBLs株陽性率(50.76%vs.56.25%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 ASB組和UTI組大腸埃希菌對18種抗菌藥物的耐藥率[n(%)]

續(xù)表5 ASB組和UTI組大腸埃希菌對18種抗菌藥物的耐藥率[n(%)]

注：-表示無數(shù)據(jù)

3 討 論

尿路感染是臨床上最普遍的細(xì)菌感染之一，并由于其易復(fù)發(fā)和易再感染，以及較高的耐藥率，一直是臨床治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。其致病機(jī)制目前仍不明確。絕大多數(shù)ASB和UTI均由UPEC引起。根據(jù)系統(tǒng)分群的結(jié)果，大腸埃希菌可以被分為A、B1、B2、D 4群。不同系統(tǒng)發(fā)育群根據(jù)其攜帶的毒力基因不同從而表現(xiàn)出不同的致病能力。既往研究顯示，B2群和D群大腸埃希菌具有較高毒力，與尿路感染的持久性或復(fù)發(fā)性有關(guān)[5-6]，而B1群菌株有黏附相關(guān)基因的高表達(dá)，這些基因與菌株定植在尿路上皮細(xì)胞有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASB組和UTI組系統(tǒng)分群結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UTI組中B2群菌株的比例明顯高于ASB組，提示具有較高毒力的B2群大腸埃希菌可能是造成典型尿路感染的主要原因。而ASB組中B1群菌株比例較高，因此其可能具有更強(qiáng)的黏附定植能力，但由于其B2群菌株比例較低，毒力較低，所以雖然能持續(xù)定植但未能造成典型尿路感染癥狀。

UPEC相關(guān)毒力因素包括：1型菌毛、P菌毛等黏附器官；α-溶血素、細(xì)胞毒壞死因子1等毒素；含鐵產(chǎn)氣桿菌素；莢膜；脂多糖和鐵攝取系統(tǒng)等。黏附是細(xì)菌致病的第一步。黏附因子各亞基在細(xì)菌表面聚集并裝配成單體、寡聚體或超分子纖維結(jié)構(gòu)菌毛，介導(dǎo)UPEC的黏附和侵襲過程。UPEC主要黏附因子包括1型、P型、S型、F1C型菌毛及Afa/Dr黏附因子家族，尤以1型菌毛最常見。fimH基因編碼1型菌毛頂端FimH蛋白，F(xiàn)imH蛋白直接介導(dǎo)UPEC與宿主細(xì)胞的黏附，是引發(fā)尿路感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，4種黏附相關(guān)基因中，fimH在ASB組和UTI組中均有較高的表達(dá)率。papA基因編碼的P菌毛亞單位A屬于黏附素，P菌毛可與人泌尿道黏膜上皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合促使細(xì)胞黏附定植，是尿路感染的首要條件。sfa基因編碼的S型菌毛屬于甘露糖抵抗的黏附素，可黏附于人的膀胱和腎臟上皮細(xì)胞。afa基因編碼產(chǎn)物則主要介導(dǎo)無菌毛黏附。本研究發(fā)現(xiàn),ASB組4種黏附基因表達(dá)率均高于UTI組，其中afa、sfa基因表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示ASB組UPEC可能具有更強(qiáng)的黏附定植能力。黏附因子被認(rèn)為是UPEC最重要的毒力因子，它的存在一方面可以幫助細(xì)菌定植在宿主泌尿道上皮細(xì)胞表面，抵御尿液沖刷；另一方面，黏附因子可以直接參與UPEC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的作用。更重要的是，在黏附因子的介導(dǎo)下，UPEC可以侵襲宿主細(xì)胞，并持續(xù)繁殖，形成細(xì)胞內(nèi)菌落群，從而逃避宿主細(xì)胞釋放的炎癥因子及免疫效應(yīng)細(xì)胞的攻擊。UPEC成為胞內(nèi)寄生菌后，不僅對抗菌藥物敏感性下降，同時免疫原性也大大降低[8]。這可能是ASB組中UPEC逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊，在宿主體內(nèi)持續(xù)增殖，形成ASB的機(jī)制之一。

除黏附外，細(xì)胞毒性相關(guān)基因和鐵攝取相關(guān)基因同樣在UPEC致病過程中起著不可或缺的作用。cnf1有助于細(xì)菌播散并持續(xù)存在于宿主上皮細(xì)胞中。hlyA則作用于宿主紅細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，幫助細(xì)菌突破尿路上皮細(xì)胞屏障。sat編碼的自轉(zhuǎn)運(yùn)毒素對膀胱和腎臟來源的細(xì)胞具有毒性。鐵是細(xì)菌生長發(fā)育不可或缺的必要元素，iutA、irp2和fyuA的基因編碼產(chǎn)物主要介導(dǎo)鐵利用和鐵攝取，可以幫助細(xì)菌定植在泌尿道這一鐵缺乏的環(huán)境中，與UPEC的毒力密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，UTI組細(xì)胞毒性相關(guān)基因及鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)率均高于ASB組，其中cnf1、hlyA，fyuA、iutA基因的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明UTI組菌株毒力強(qiáng)于ASB組，ASB組菌株較低的毒力基因表達(dá)率可能降低了其急性致病能力，使其較少引起典型上尿路感染癥狀和腎盂腎炎等。也有部分學(xué)者提出一種假設(shè)，認(rèn)為這可能是ASB組菌株為了適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境，選擇性失活和不表達(dá)一些毒力基因，這樣可以降低激活宿主固有免疫系統(tǒng)的概率，從而達(dá)到在宿主體內(nèi)長期定植而不被消滅的目的。甚至有研究認(rèn)為，ASB不一定需要治療，因?yàn)檫@種毒性較低的UPEC菌株的持續(xù)定植狀態(tài)有助于防御更容易耐藥或更高毒力菌株的侵襲[10]。

本研究中，雖然ASB組和UTI組UPEC具有不同的系統(tǒng)分群特征及不同的毒力基因表達(dá)率，但其對18種抗菌藥物的耐藥率相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的感染率不斷上升，本研究中，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在ASB組和UTI組中的比例均超過50%。目前臨床上對尿路感染的經(jīng)驗(yàn)治療常選用氟喹諾酮類藥物，但本研究發(fā)現(xiàn)UPEC對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率均在50%左右。這都提示我國UPEC耐藥情況處于十分嚴(yán)峻的狀態(tài)，在臨床上必須引起重視。

綜上所述，UTI和ASB分離的大腸埃希菌，具有不同的系統(tǒng)分群特征，這可能與其表現(xiàn)出的不同致病能力相關(guān)。ASB菌株黏附相關(guān)基因的表達(dá)率更高，有助于細(xì)菌黏附在尿路上皮細(xì)胞，抵御尿液的沖刷，同時可能有助于菌株形成胞內(nèi)寄生菌，逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)定植狀態(tài)。ASB菌株毒力較UTI低，這可能是其定植在宿主體內(nèi)但未能引起典型尿路感染臨床癥狀的原因。此外，ASB和UTI分離的大腸埃希菌存在嚴(yán)重耐藥情況，在臨床上必須注意謹(jǐn)慎選擇抗菌藥物，謹(jǐn)防濫用。