玉米根際土壤中鐮孢菌的構成與定量分析

葛波，王寶寶，郭成，孫素麗，陳國康，王曉鳴，朱振東，段燦星

?

玉米根際土壤中鐮孢菌的構成與定量分析

葛波1,2，王寶寶1，郭成3，孫素麗1，陳國康2，王曉鳴1，朱振東1，段燦星1

（1中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081；2西南大學植物保護學院，重慶 400715；3甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

【目的】了解我國玉米根際土壤鐮孢菌（spp.）的種群結構及相對含量，為相關土傳病害的發生提供早期預警。【方法】從全國17個省（自治區、直轄市）采集的47份玉米田間土樣中，采用稀釋涂布平板法共分離到58個鐮孢菌分離物，通過形態學、特異性引物及基因測序等方法進行鑒定，從GenBank以及鐮孢菌數據庫MLST中下載標準參照菌株，利用MEGA 6.0軟件以鄰接法構建多基因位點系統發育樹；挑選代表菌株利用玉米自交系黃早四分別進行幼苗、種子以及離體葉片的致病性測定；基于已建立的實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測體系，提取土壤總DNA對玉米土樣中鐮孢菌屬以及部分種的含量進行檢測，針對不同玉米產區進行劃分統計。【結果】共鑒定出9種鐮孢菌，其中擬輪枝鐮孢（）（22.41%）、木賊鐮孢（）（20.69%）、禾谷鐮孢復合種（species complex）（18.97%）分離頻率較高，其余為尖鐮孢復合種（species complex）、層出鐮孢（）、單隔鐮孢（）、銳頂鐮孢（）、茄鐮孢（）和居群鐮孢（），分離頻率分別為12.07%、8.62%、5.17%、5.17%、3.40%和3.40%，相同鐮孢菌與其參照菌株處于同一分支，不同區域的鐮孢菌存在多樣性；致病性測定結果顯示除單隔鐮孢外，其余鐮孢菌均具有致病性，但致病力各不相同，同一鐮孢種的不同菌株間致病性也不盡相同；其中居群鐮孢為首次在玉米根際土壤中發現，并首次證實其對玉米具有致病性。RT-qPCR檢測結果表明，玉米根際土壤中鐮孢菌屬、擬輪枝鐮孢與禾谷鐮孢復合種的含量分別為2.91—169.90、0.08—5.34和0.76—78.37 pg·g-1，各玉米產區的鐮孢菌含量不同，其中禾谷鐮孢含量均大于擬輪枝鐮孢。【結論】玉米根際土壤中鐮孢菌種類眾多，其中擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢和禾谷鐮孢復合種為優勢鐮孢種，各地區的鐮孢菌含量均不相同，其中西南山地玉米區的鐮孢菌含量最多，黃淮海玉米區的禾谷鐮孢含量高于其他區域。

玉米；根際土壤；鐮孢菌；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】玉米是我國最主要的糧食作物之一，鐮孢菌（spp.）能引起多種玉米土傳病害，如苗枯病、根腐病、莖腐病和穗腐病等，其中鐮孢莖腐病和穗腐病已成為我國玉米生產上的主要病害，嚴重影響玉米的產量和品質，制約玉米全程機械化發展；此外，鐮孢菌能產生多種真菌毒素，如伏馬毒素、單端孢霉烯族毒素等，直接危害人畜健康[1-5]。鐮孢菌分布極廣，普遍存在于土壤及動植物有機體上，能以死體營養的方式在土壤和病殘體上越冬，導致玉米田土壤中積累的鐮孢菌成為病害發生的重要侵染源，因此，明確土壤中致病鐮孢菌的種類和含量對于玉米土傳病害的有效防控具有重要指導意義。【前人研究進展】針對土壤中鐮孢菌的分離報道較多，唐琳等[6]從河南西部地區的茄科作物土樣中分離鑒定了5個鐮孢種，分別為尖鐮孢（）、藤倉鐮孢（）、擬輪枝鐮孢（）、變紅鐮孢（）和變紅-木賊鐮孢復合種（species complex），其中尖鐮孢的分離頻率高達45.83%；黎永堅等[7]對廣東珠海的粉蕉種植土壤鐮孢菌進行了分離鑒定，發現了茄鐮孢（）、尖鐮孢、木賊鐮孢（）、層出鐮孢（）和擬輪枝鐮孢。稀釋平板法具有操作簡便、快捷和易成功等優點[8-9]，成為土壤微生物分離培養及衡量微生物小群體多樣性的常規手段，但該方法的缺點是無法真實反映出自然條件下鐮孢菌的數量。近年來，隨著實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術在植物病原菌研究上的不斷深入，大大提高了植物病原菌的檢測效率和監測防治水平，利用其對土壤中植物病原菌實時定量檢測的研究更是屢見報道，RT-qPCR技術在進行大量樣品中鐮孢菌種群密度分析及后續病原菌檢測監控中具有不可替代的優勢[10-13]。【本研究切入點】近年來，由于秸稈還田以及栽培管理方式變更等原因，造成玉米土壤中鐮孢菌不斷積累，導致土傳病害發生不斷加重。目前，有關玉米根際土壤鐮孢菌的研究報道極少，針對玉米土傳病害開展流行預警和防控措施缺乏理論依據。【擬解決的關鍵問題】對從全國17個省（自治區、直轄市）采集的47份土樣中分離得到的58個鐮孢菌分離物進行形態學及分子特征鑒定，利用已建立的熒光定量檢測體系對鐮孢屬、擬輪枝鐮孢與禾谷鐮孢復合種（species complex）進行定量檢測，以期明確玉米土樣中的鐮孢菌的種類和數量，為相關土傳病害的發生提供早期預警。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品：2017年在全國23個地區的玉米主產區采用五點法隨機選取玉米，挖取其根部體積為25 cm×25cm×25 cm土壤，并去除0—5 cm土層的表土，采用抖根法[14]提取根際土樣，共得到了47份不同地點的土壤樣本，將采集的土樣置于無菌封口袋中，帶回實驗室過篩保存。

實驗儀器：Retsch MM400混合研磨儀、Sigma高速大量冷凍離心機、DYY-12型電泳儀、GeneAmp PCR Syetem 9700 基因擴增儀、ABI 9700熒光定量儀、Tanon 4100凝膠成像系統、Q5000超微量核酸蛋白測定儀、HZQ-F160全溫振蕩培養箱。常用試劑：dNTPs、10×PCR buffer、Taq聚合酶。SYBR Green I（Takara）、BioFast Soil Genomic DNA Extraction Kit（杭州博日科技有限公司）；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒；特異性引物（上海生工）。

PPA培養基[15]：15.0 g蛋白胨，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，1.0 g PCNB，20.0 g瓊脂，水1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 分離鑒定 鐮孢菌分離：稱取土樣5.0 g放入盛45 mL無菌水并帶有玻璃珠的200 mL三角瓶中，混合后置于搖床振蕩15 min使土樣均勻形成土壤懸液，吸取土壤懸液按照10倍梯度稀釋法進行稀釋，分別吸100 μL稀釋液均勻涂布于PPA培養基中，26℃恒溫箱培養，培養4—6 d，待形成菌落后，挑取疑似鐮孢菌菌落的最外緣菌絲于新的PDA培養基上，7 d后，進行病原菌種類鑒定。

形態學鑒定：挑取純化后的鐮刀菌絲接種于PDA、SNA培養基上，28℃恒溫箱，12 h黑暗交替培養，6 d后計算生長速率，記錄菌落形態和色素產生情況，在顯微鏡下觀察分生孢子等結構的生長情況，具體參考《常見鐮刀菌鑒定指南》[16]、《TheLaboratory Manual》[15]，采用Booth體系進行鑒定。

分子特征鑒定：將得到的單孢菌株轉移到貼有滅菌玻璃紙的PDA培養皿上，25℃培養7 d，刮取菌絲風干，液氮研磨充分后按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工）提取DNA。利用鐮孢種的特異性引物（表1）進行PCR檢測，確定菌株的具體屬以及種。利用以及基因序列分析方法進行進一步鑒定。引物序列ITS1（GAAGTAAAAGTCGAAC AAG）和ITS4（CCTCCGCTTATTGATATGC）；TEF-F（ATGGGTAAGGARGACAAGAC）和TEF-R（GG ARGTACCAGTSATCATGTT），PCR擴增產物進行1.0%的瓊脂糖檢測后送北京生工有限公司進行測序。測序結果與NCBI的鐮孢菌序列進行比對鑒定，從GenBank以及鐮孢菌數據庫MLST中下載標準參照菌株，利用MEGA 6.0軟件以鄰接法構建多基因位點系統發育樹。

常規PCR擴增體系：選用10.0 μL的反應體系，模板1.0 μL，引物上下游各0.5 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 1.0 μL（2.5 mmol·L-1），dNTP 0.5 μL（2.5 mmol·L-1），Taq酶0.25 μL（5 U·μL-1），ddH2O 6.25 μL補至10.0 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。

1.2.2 致病力測定 玉米種子致病性測定：選擇玉米感病自交系黃早四，進行種子表面滅菌即75%酒精漂洗4 min，無菌水漂洗2次，放在無菌濾紙上風干。將純化后的鐮孢菌分離物接種在不加瓊脂的SNA培養基上，全溫振蕩培養箱25℃，120 r/min培養3 d，在顯微鏡下計算孢子濃度，并將濃度稀釋至2×106個/mL。將滅菌濾紙放在平皿里，每皿放置5粒玉米種子，每個菌株設置3皿，用孢子液分別浸泡接菌黃早四玉米種子，設無菌水浸泡為空白對照，封口后置于26℃恒溫培養箱內，7 d后調查種子發病情況，統計發病率。

玉米幼苗致病性測定：將滅菌后的黃早四玉米種子播種在紙杯中，適時澆水，觀察生長情況。選擇玉米3葉期進行蘸根接種，每個菌株對5株玉米苗進行接種，設空白對照。14 d后，調查玉米植株的發病情況，統計發病率。從發病的玉米葉片的病斑上分離出致病菌，于滅過菌的PDA培養基上培養，備用。

玉米離體葉片致病性測定：用打孔器從已培養7 d的病斑分離菌的PDA平皿上的菌落邊緣打下菌餅，菌絲面朝下貼于經酒精擦拭的黃早四玉米葉片上，每個菌株兩片葉片，以無菌PDA培養基菌餅為對照，26℃保濕培養5 d后觀察發病情況。

從各發病部位重新分離菌株，進行形態學鑒定。

1.2.3 熒光定量檢測 取土樣過篩，混合均勻后，稱取1 g土樣按照BioFast Soil Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取土壤總DNA。提取不同地點的共47份帶菌土樣總DNA利用已有的檢測體系分別進行鐮孢屬、禾谷鐮孢以及擬輪枝鐮孢RT-qPCR檢測，熒光PCR擴增體系：反應混合液總體積20.0 μL，包括10.0 μL的SYBR Premix Ex TaqTM（2×），0.4 μL的ROX Reference Dye Ⅱ（50×），引物各0.8 μL（10 μmol·L-1），模板2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。優化后的反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，退火34 s，40個循環；95℃ 15 s ，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，引物及曲線方程見表2，將土樣檢測量根據不同玉米種植區進行劃分，計算各區域鐮孢菌的平均含量，由于西北灌溉玉米區樣本數較少，數據缺乏一定的代表性，不考慮分析。

表1 鐮孢菌的特異性引物

表2 RT-qPCR的引物及曲線信息

2 結果

2.1 鐮孢菌鑒定

基于形態學特征初步確定為鐮孢菌的58個分離物，進行鐮孢菌屬特異性引物ItsF/R的PCR擴增，結果表明所有分離物均能穩定擴增出431 bp目標片段（圖1-A），確定為鐮孢菌。利用鐮孢種的特異性引物分別對58個單孢分離物進行擴增，其中13株擴增出單一的578 bp VER1/2特異性條帶（圖1-B），確定為擬輪枝鐮孢；9株擴增出340 bp目標片段（圖1-C），為尖鐮孢復合種；11株擴增出280 bp目標片段（圖1-D），為禾谷鐮孢復合種；其余25個未擴增出任何目標片段以及9株尖鐮孢復合種，通過對其進行基因測序分析，經BLAST比對后確定為木賊鐮孢、茄鐮孢、銳頂鐮孢（）、層出鐮孢、單隔鐮孢（）和居群鐮孢（）。構建發育樹所用的菌株信息見表3，系統發育樹將不同鐮孢種明顯區分開來，9個經尖鐮孢特異性引物檢測呈陽性的分離物，其中兩株與處于同一分支（圖2）。

M: D2000。A：鐮孢菌的PCR檢測PCR amplification of Fusarium spp, 1-10: S10-3, S30-1, S40-6, S31-3, S2, S8, S19-3, S1-4, S46-1, S22-2；B：擬輪枝鐮孢的PCR檢測PCR amplification of F. verticillioides, 1-10: S21-2, S31-5, S44-1, S1-4, S43-1, S44-3, S11-4, S31-2, S37-6, S21；C：尖鐮孢復合種的PCR檢測PCR amplification of F. oxysporum species complex, 1-9: S8, S46-1, S19-3, S6-3, S30-2, S6, S2-3, S24-4, S7；D：禾谷鐮孢復合種的PCR檢測PCR amplification of F. graminearum species complex, 1-9: S31-1-2, S40-8, S40-6, S22-2, S22-1, S40-1, S31-1, S16-3, S15-2

2.2 鐮孢菌種的分離頻率與地域分布

通過對各鐮孢種的分離頻率進行統計發現，擬輪枝鐮孢分離頻率最高，為22.41%；其次是木賊鐮孢、禾谷鐮孢復合種、尖鐮孢復合種，分別為20.69%、18.97%、12.07%；其他如層出鐮孢、茄鐮孢、銳頂鐮孢、單隔鐮孢、居群鐮孢的分離頻率較低，分別為8.62%、3.40%、5.17%、5.17%、3.40%。從鐮孢菌種類區域性分布看（表4），擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復合種、木賊鐮孢以及尖鐮孢復合種在每個玉米產區均有分離，為主要鐮孢菌，且不同玉米產區的鐮孢菌的分離頻率不盡相同。居群鐮孢只在河南新鄉的土樣中分離得到，在玉米根際土壤中分離出該菌尚屬首次。

2.3 鐮孢菌致病性測定

將9種不同的鐮孢菌分別挑選2株代表菌株進行致病性測定，大部分菌株具有致病性（圖3、表5），但致病力有所差別，其中單隔鐮孢的致病性測定結果為均不發病，說明其并不對玉米致病。相同鐮孢菌的不同菌株間致病性也不盡相同，如禾谷鐮孢S40-8與S31-1-2、木賊鐮孢S7-2與S40-7。離體葉片的致病性測定表明，禾谷鐮孢、木賊鐮孢、銳頂鐮孢以及單隔鐮孢對玉米葉片不致病，致病菌重新進行分離后的形態學鑒定顯示為對應菌（圖4）。

圖2 基于ITS、TEF-1α序列構建的鐮孢菌系統發育樹

表3 構建發育樹所用的菌株信息

表4 玉米土樣鐮孢菌分離頻率

2.4 土壤鐮孢菌含量檢測及分析

玉米根際土樣中鐮孢菌屬（表6）的含量為2.91—169.90 pg·g-1，其中含量≤10 pg·g-1的樣品7份，≤100 pg·g-1的樣品36份，4份樣品含量＞100 pg·g-1，各樣品的含量不同，且在不同時期采取的土樣含量也不同。禾谷鐮孢的含量最大為78.37 pg·g-1，最小僅為0.76 pg·g-1，各樣品的含菌量各異，但含量在1—10pg·g-1的樣品最多，共計31份，占總量的70%，其中含菌量最大的是北京昌平實驗站的土樣，含量為78.37 pg·g-1，擬輪枝鐮孢含量檢測結果顯示，47份樣品中的濃度各異，但含量均＜10 pg·g-1，最大的為湖北恩施的土樣，5.34pg·g-1。其中＜1 pg·g-1的共計有35份。

如表7可見，各玉米產區的含菌量各異，其中西南山地玉米區的鐮孢菌含量最高，黃淮海夏播玉米區的禾谷鐮孢含量較其他種植區高。

3 討論

本研究中，除廣泛分布的擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復合種和尖鐮孢復合種外，同時也分離到其他6種致病鐮孢，其中木賊鐮孢分離頻率相對較高，是土壤中的常見鐮孢菌，這與鄒慶甲等對土樣的分離結果相似，其余的包括茄鐮孢、層出鐮孢、單隔鐮孢、銳頂鐮孢的分離頻率較低，只能在少部分的地區可以分離得到[24]。鐮孢菌分離頻率的差異與每個玉米產區的氣候、環境、耕作制度及種植品種都有一定關系，也不排除樣本量小的原因。本文通過對全國各大玉米產區的土樣進行分離鑒定，了解各玉米產區土樣中鐮孢菌的種類與分布，為玉米土傳病害的預防提供了一定的參考依據。針對鐮孢菌的分子鑒定，以及的檢測均有報道，本文通過雙基因構建系統發育樹，進一步確認鑒定得到的鐮孢菌，具有更好的準確性[4-6,24]。

發病植株Infected seedling：居群鐮孢F. commune；發病種子Infected seed：禾谷鐮孢F. graminearum。A：擬輪枝鐮孢F. verticillioides；B：尖鐮孢F. oxysporum；C：居群鐮孢F. commune；D：禾谷鐮孢F. graminearum；E：木賊鐮孢F. equiseti；F：銳頂鐮孢F. acuminatum；G：單隔鐮孢F. dimerum；H：茄鐮孢F. solani；I：層出鐮孢F. proliferatum

表5 鐮孢菌對玉米的致病性測定

“+”：離體葉片接種發病The incidence ofleaf inoculation；“－”：離體葉片未發病No leaf lesions

表6 不同地點土樣鐮孢菌含量檢測

表中數據為平均數±標準誤 Data in the table are average±SE

A：擬輪枝鐮孢F. verticillioides；B：層出鐮孢F. proliferatum；C：木賊鐮孢F. equiseti

表7 不同玉米產區鐮孢菌檢測含量

通過3種致病力檢測發現，單隔鐮孢并不對玉米致病，是引起枸杞根腐病的主要致病菌[25]。致病力較弱的為銳頂鐮孢和居群鐮孢，其中銳頂鐮孢的致病寄主廣泛，包括小麥、苜蓿、玉竹等，主要引起大豆根腐病，也有引起玉米穗腐的報道[26-29]。本研究分離得到的2個居群鐮孢分離物，是荷花腐敗病與荸薺枯萎病的致病菌[30-31]，為尖鐮孢的近源種，致病性測定表明，該菌在玉米上可以致病，尚屬首次。

通過對47份土樣的擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢以及鐮孢菌屬的RT-qPCR檢測，結合鐮孢菌分離頻率進行分析，其中分離頻率最高的擬輪枝鐮孢其檢測含量較禾谷鐮孢低，可能與擬輪枝鐮孢可產生眾多的小型分生孢子，更容易分離得到有關，培養基的選擇同樣也影響著分離頻率。不同土樣中的鐮孢菌含量各不相同，其中北京昌平的土樣中鐮孢菌含量較其他地區土樣的高，尤其是禾谷鐮孢的含量。究其原因，可能是由于土樣來自本實驗室用于玉米穗腐病抗性鑒定的地塊，玉米鐮孢穗腐病的人工接種有助于土壤中禾谷鐮孢的積累。

鑒于玉米產區是根據不同種植習慣以及壞境條件來區分的，通過統計比較每個玉米產區的鐮孢菌含量，其中以黃淮海夏播玉米區的禾谷鐮孢復合種的平均含量最高，了解到該區的主要種植方式是小麥玉米兩茬套種，禾谷鐮孢亦是小麥主要病害赤霉病的致病菌，小麥以及玉米均可為禾谷鐮孢的積累提供寄主，連年積累的土樣中的含量相對而言高于其他種植區域。

4 結論

從采自17個省（自治區、直轄市）的47份玉米根際土壤中分離鑒定出9種鐮孢菌，其中擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢和禾谷鐮孢復合種為優勢鐮孢種，居群鐮孢為首次在玉米根際土壤中分離得到，并證實其對玉米具有致病性。不同地區的土樣中鐮孢菌含量差異較大，西南山地玉米區的鐮孢菌含量最多，黃淮海玉米土樣中的禾谷鐮孢含量高于其他區域。

[1] 紀莉景, 栗秋生, 王連生, 李聰聰, 孔令曉. 河北省夏玉米苗期根病發生現狀及病原初探. 玉米科學, 2014, 22(6): 138-141.

JI L J, LI Q S, WANG L S, LI C C, KONG L X. Occurrence and identification of maize root rot diseases and the pathogens in Hebei Province., 2014, 22(6): 138-141. (in Chinese)

[2] Duan C X, Qin Z H, Yang Z H, Li W X, Sun S L, Zhu Z D, Wang X M. Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and potential mycotoxin production in China., 2016, 8(6): 186.

[3] Lal S, Singh I S. Breeding for resistance to downy mildews and stalk rots in maize., 1984, 69(2): 111-119.

[4] 秦子惠, 任旭, 江凱, 武小菲, 楊知還, 王曉鳴. 我國玉米穗腐病致病鐮孢種群及禾谷鐮孢復合種的鑒定. 植物保護學報, 2014, 41(5): 589-596.

QIN Z H, REN X, JIANG K, WU X F, YANG Z H, WANG X M. Identification ofspecies andspecies complex causing maize ear rot in China., 2014, 41(5): 589-596. (in Chinese)

[5] 郭成, 魏宏玉, 郭滿庫, 何蘇琴, 金社林, 陳紅梅, 王曉鳴, 郭建國. 甘肅玉米穗腐病樣品中輪枝鐮孢菌的分離鑒定及生物學特性. 植物病理學報, 2014, 44(1): 17-25.

GUO C, WEI H Y, GUO M K, HE S Q, JIN S L, CHEN H M, WANG X M, GUO J G. Isolation, identification and biological characteristics offrom maize ear rot samples in Gansu Province., 2014, 44(1): 17-25. (in Chinese)

[6] 唐琳, 趙輝. 豫西地區茄科作物土壤鐮孢菌的種群多樣性分析. 中國蔬菜, 2013(24): 65-69.

TANG L, ZHAO H. Species diversity analysis onof Solanaceae crops soil in western Henan Province., 2013(24): 65-69. (in Chinese)

[7] 黎永堅, 陳遠鳳, 喻國輝, 陳燕紅, 戴宇光. 粉蕉種植土鐮刀菌分離與鑒定. 廣東農業科學, 2014(16): 74-80.

LI Y J, CHEN Y F, YU G H, CHEN Y H, DAI Y G. Separation and identification ofin banana planted soil., 2014(16): 74-80. (in Chinese)

[8] 劉金波, 許艷麗, 魏巍. 大豆根際土壤鐮孢菌不同分離方法比較. 大豆科學, 2008, 27(1): 106-112.

LIU J B, XU Y L, WEI W. Comparing different methods for isolatingfrom soybean rhizosphere soil., 2008, 27(1): 106-112. (in Chinese)

[9] 孫廣林, 夏永勝, 張中原. 關于大豆配方施肥的研究與應用. 土壤通報, 2007, 38(3): 527-530.

SUN G L, XIA Y S, ZHANG Z Y. Recommended fertilization for soybean and its application., 2007, 38(3): 527-530. (in Chinese)

[10] 魏巍, 許艷麗, 劉金波, 李春杰, 韓曉增, 李文濱, 李淑嫻. 土壤鐮孢菌real-time qPCR定量方法的建立及應用. 大豆科學, 2010, 29(4): 655-658, 662.

Wei W, Xu Y L, Liu J B, Li C J, Han X Z, Li W B, Li S X. Development and application of a real-time quantitative PCR assay for detection ofspp. in soil., 2010, 29(4): 655-658, 662. (in Chinese)

[11] SCHENA L, NIGRO F, IPPOLITO A. Real-time PCR detection and quantification of soilborne fungal pathogens: the case of,,, and., 2004, 43: 273-280.

[12] 王宏樂. 熒光定量PCR監測黃瓜根分泌物對土壤中枯萎病菌生物量的影響. 上海交通大學學報 (農業科學版), 2010, 28(1): 41-45.

WANG H L. Effects of root exudates of cucumber on population off. sp.in soil as detected by real-time PCR., 2010, 28(1): 41-45. (in Chinese)

[13] Nam H M, Srinivasan V, Gillespie B E, Murinda S E, Oliver S P. Application of SYBR green real-time PCR assay for specific detection ofspp. in dairy farm environmental samples., 2005, 102(2): 161-171.

[14] 魯如坤. 土壤農業化學分析方法. 北京: 中國農業科學技術出版社, 1999.

Lu C K.. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 1999. (in Chinese)

[15] Leslie J F, Summerell B A.. Blackwell Pub Professional, 2006.

[16] 王拱辰. 常見鐮刀菌鑒定指南. 北京: 中國農業科學技術出版社, 1996.

Wang G C.. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 1996. (in Chinese)

[17] Bluhm B H, Flaherty J E, Cousin M A, Woloshuk C P. Multiplex polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene- and fumonisin-producing species ofin cornmeal., 2002, 65(12): 1955-1961.

[18] Nicholson P, Simpson D R, Weston G, Rezanoor H N, Lees A K, PARRY D W, JOYCE D. Detection and quantification ofandin cereals using PCR assays., 1998, 53(1): 17-37.

[19] Mishra P K, Fox R T, Culham A. Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria., 2003, 218(2): 329-332.

[20] Mule G, Susca A, Stea G, Moretti A. A species-specific PCR assay based on the calmodulin partial gene for identification of,and., 2004, 110(5/6): 495-502.

[21] 葛波. 土壤鐮孢菌檢測技術的建立及其應用[D]. 重慶: 西南大學, 2018.

GE B. Establishment and application of detection technology forspp. in soil[D]. Chongqing: Southwest University, 2018. (in Chinese)

[22] 葛波, 楊洋, 張申萍, 王曉鳴, 陳國康, 段燦星. 禾谷鐮孢熒光定量檢測體系的建立及其在玉米苗枯病上的應用. 植物保護學報, 2018, 45(3): 409-415.

GE B, YANG Y, ZHANG S P, WANG X M, CHEN G K, DUAN C X. Development of fluorescent quantitative detection system for fungal pathogenand its application in maize seedling blight., 2018, 45(3): 409-415. (in Chinese)

[23] 周丹妮. 重慶地區玉米穗腐病致病鐮孢鑒定及其產毒能力分析[D]. 重慶: 西南大學, 2017.

ZHOU D N. Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and analysis of their toxigenicity in Chongqing[D]. Chongqing: Southwest University, 2017. (in Chinese)

[24] 鄒慶甲, 王樹桐, 梁魁景, 王亞南, 胡同樂, 韓之琪, 曹克強. 河北省蘋果園土壤中疑似致病鐮孢菌種類. 菌物學報, 2014, 33(5): 976-983.

ZOU Q J, WANG S T, LIANG K J, WANG Y N, HU T L, HAN Z Q, CAO K Q. Suspected pathogenicspp. isolated from apple orchard soils in Hebei Province., 2014, 33(5): 976-983. (in Chinese)

[25] 李捷. 甘肅省枸杞根腐病病原及生理生化抗病機理研究[D]. 蘭州: 甘肅農業大學, 2015.

LI J. The root rot pathogens ofin Gansu Province and physiological biochemical mechanism of resistance[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2015.(in Chinese)

[26] Arias M M, Leandro L F, Munkvold G P. Aggressiveness ofspecies and impact of root infection on growth and yield of soybeans., 2013, 103(8): 822-832.

[27] 支葉, 孫菲菲, 孫素麗, 段燦星, 朱振東. 黑龍江省大豆根腐病菌銳頂鐮孢鑒定. 中國油料作物學報, 2014, 36(6): 789-793.

ZHI Y, SUN F F, SUN S L, DUAN C X, ZHU Z D. Identification ofcausing soybean root rot in Heilongjiang Province., 2014, 36(6): 789-793. (in Chinese)

[28] Mesterházy, Lemmens M, Reid L M. Breeding for resistance to ear rots caused byspp. in maize-a review., 2012, 131(1): 1-19.

[29] 周陽陽, 楊洪一. 玉竹銳頂鐮孢菌的生物學特性及藥劑防治. 中國農學通報, 2010, 26(9): 315-318.

Zhou Y Y, Yang H Y. Biological characterization and chemical on the control ofpathogen of., 2010, 26(9): 315-318. (in Chinese)

[30] 曾莉莎, 鄭芝波, 呂順, 夏玲, 鄧志平, 胡規媛, 杜彩嫻, 麥進培, 周建坤. 荷花腐敗病病原菌的形態學與多基因分子系統學鑒定. 植物病理學報, 2017, 47(2): 162-173.

ZENG L S, ZHENG Z B, Lü S, XIA L, DENG Z P, HU G Y, Du C X, MAI J P, ZHOU J K. Identification of pathogen causing rhizome rot of lotus () based on morphology and multi-gene sequence analysis., 2017, 47(2): 162-173. (in Chinese)

[31] 朱志賢. 荸薺枯萎病菌病原學、分子檢測及防治技術研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2014.

ZHU Z X. Etiology, detection and control ofFusarium wilt of Chinese water chestnut[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2014.(in Chinese)

（責任編輯 岳梅）

Composition and quantitative analysis ofspecies in maize rhizosphere soil

GE Bo1,2, WANG BaoBao1, GUO Cheng3, SUN SuLi1, CHEN GuoKang2, WANG XiaoMing1, ZHU ZhenDong1, DUAN CanXing1

(1Institute of Crop Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715;3Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070)

【Objective】The objective of this study is to understand the population structure and relative content ofspp. in maize rhizosphere soil in China, and to provide an early warning of the occurrence of soil-borne maize diseases.【Method】Using dilution plate method, a total of 58isolates were obtained from 47 maize soil samples of 17 provinces (autonomous region, municipality). Based on morphological characteristic, specific PCR amplification, andandgene sequences analysis, thesespp. were further determined. The reference strain sequences were downloaded from GenBank andMLST. Multi-gene loci phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining method (NJ) using MEGA 6.0 software. Some representative strains were selected for pathogenicity test by maize seedlings, seeds andleaves infection. The content ofspp. and some species in maize rhizosphere soil samples was detected using RT-qPCR determination system. Statistical analysis was carried out for different maize producing areas.【Result】 A total of 9species were identified. Among them,(22.41%),(20.69%) andspecies complex (18.97%) were isolated more frequently. The rest of 6 species werespecies complex,,,,and, with the isolation frequency of 12.07%, 8.62%, 5.17%, 5.17%, 3.40%, and 3.40%, respectively. The results showed that the samespp. and the reference strain were in the same branch, and the diversity ofspp. existed in different regions. Allspecies were pathogenic except.was isolated from maize rhizosphere soil and confirmed to be pathogenic to maize seed, seedling, and detached leaf for the first time. The pathogenicity of different strains of the samespecies was not the same. Using RT-qPCR detection system, the total of,andspecies complex in maize soil samples were quantitatively assayed, with the content range of 2.91-169.90, 0.08-5.34 and 0.76-78.37 pg·g-1, respectively. The content ofspecies in different maize producing areas was different, and the content ofwas higher than that of【Conclusion】There are multiple species ofin maize rhizosphere soil and,, andspecies complex are dominant species. The content ofspp. differs in different areas. Among them, the content ofspp. is the highest in Southwest mountainous area of maize, and thecontent in the Huang-huai-hai summer sowing maize area is higher than that in other regions.

maize;rhizosphere soil;spp.; RT-qPCR

2018-04-11；

2018-06-12

國家重點研發計劃（2016YFD0100103）、國家現代農業（玉米）產業技術體系（CARS-02）、中國農業科學院農業科技創新工程

葛波，E-mail：295024054@qq.com。 通信作者段燦星，E-mail：duancanxing@caas.cn