核盤菌γ-谷氨酰磷酸還原酶基因SsGPR1的功能分析

杜嬌，王婭波，李雪華，黃志強，楊宇衡，畢朝位，余洋

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核盤菌-谷氨酰磷酸還原酶基因的功能分析

杜嬌，王婭波，李雪華，黃志強，楊宇衡，畢朝位，余洋

（西南大學植物保護學院，重慶 400715）

【目的】-谷氨酰磷酸還原酶是真菌脯氨酸合成途徑中的一個關鍵性酶，本研究旨在對核盤菌（）-谷氨酰磷酸還原酶編碼基因進行沉默，并對沉默轉化子菌絲生長、菌核形成和致病力等表型進行研究，為揭示核盤菌的生長發育與致病機理打下基礎，并為作物菌核病的綠色防控提供線索。【方法】通過BLAST進行蛋白同源比對分析，并利用MEGA 5.0軟件構建蛋白進化樹。通過實時熒光RT-PCR檢測在核盤菌菌絲生長、菌核發育和萌發的各個階段以及致病不同時期的表達模式。根據RNA干擾原理構建的沉默載體，通過PEG介導原生質體轉化的方法將沉默載體轉入到野生型核盤菌菌株1980中。利用實時熒光RT-PCR鑒定基因沉默轉化子，對沉默轉化子的菌絲形態、生長速度和菌核形成等表型進行觀察，并測定沉默轉化子在氧化脅迫條件下的菌絲生長。將沉默轉化子分別接種至活體油菜葉片和擬南芥植株，觀察并測量病斑大小。通過酸性茚三酮法對沉默轉化子中的游離脯氨酸進行測定。【結果】核盤菌全長1 454 bp，編碼449個氨基酸，在氨基酸H10-N426處含有谷氨酰磷酸還原酶結構域。同源比對發現SsGPR1蛋白與灰葡萄孢（）的BC1G_13183蛋白和白霉病菌（）的SBOR_2215蛋白相似性最高，氨基酸序列一致性分別達95%和94%，系統進化樹結果表明三者聚為一個小的分支。在核盤菌菌絲生長時期的表達量較高，在菌核不同發育階段表達量相近，但均低于菌絲生長時期。在致病時期表達量不斷升高，在接種后9 h表達量最高。將基因沉默載體pSIGPR1導入到核盤菌野生型菌株中，并通過實時熒光RT-PCR檢測不同轉化子中的表達水平，結果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149為基因沉默轉化子。沉默轉化子在PDA培養基上形成的菌核數量及均重與野生型菌株無顯著性差異，且菌核均能萌發形成子囊盤，但菌絲生長稠密，生長速度顯著下降。在含有H2O2的培養基中，基因沉默轉化子菌絲生長受到更強的抑制，表明沉默轉化子對氧化脅迫更加敏感。基因沉默轉化子在活體油菜葉片和擬南芥植株上能引起發病，但病斑面積減小，表明沉默轉化子致病力減弱。基因沉默轉化子菌絲中的游離脯氨酸含量與野生型菌株相比無顯著差異。【結論】與核盤菌的生長和菌絲形態相關，且參與核盤菌對氧化脅迫的抵御及致病過程。

核盤菌；脯氨酸；-谷氨酰磷酸還原酶；基因沉默；致病性; 氧化壓力

0 引言

【研究意義】核盤菌（）是一種世界范圍內分布的病原真菌，能侵染400多種植物[1-3]，給農業生產造成巨大的經濟損失。一般認為核盤菌是典型的死體營養型病原菌，其通過產生細胞壁降解酶和草酸殺死寄主植物從而獲取營養[4-7]。但最近的研究表明，核盤菌在侵染寄主早期階段存在短暫的活體營養階段，其與寄主之間的相互作用比之前認為的更為復雜[7-9]，對其致病機理有待于進一步深入解析。脯氨酸具有高度水溶性和兩親性，在細胞代謝、生物抗逆等過程中發揮至關重要的作用[10]。解析脯氨酸合成相關基因在核盤菌生長發育及致病過程中的作用，對揭示其抵御逆境和致病的分子機理并進一步探索菌核病的綠色高效防控技術具有重要意義。【前人研究進展】當生物遭受干旱、低溫和高鹽等逆境時，細胞會發生滲透脅迫，為適應逆境，生物通常會在短時間內積累一些小分子滲透調節物質，如脯氨酸、甜菜堿等，以此增強對滲透脅迫的抵抗能力，維持膜完整性[11-12]。在哺乳動物中，脯氨酸被發現廣泛參與蛋白質的合成、結構和代謝，在傷口愈合、抗氧化反應及免疫反應中發揮作用[13]。在植物中，脯氨酸除了作為滲透調節物質外，還是一種抗氧化劑、生長發育信號和分子伴侶[14]。Nanjo等[15]研究發現，抑制擬南芥中脯氨酸脫氫酶的表達，轉基因植株中脯氨酸水平升高，對寒冷、高鹽的耐受性增強；Székely等[16]敲除了擬南芥脯氨酸合成的Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的兩個編碼基因和，發現的敲除突變導致脅迫誘導的脯氨酸合成減少、對鹽脅迫具超敏感性和活性氧積累，的缺失則導致種子發育后期的胚胎敗育。在真菌中，Takagi[17]通過破壞釀酒酵母（）中參與脯氨酸降解的和過量表達編碼-谷氨酸激酶的來增強脯氨酸的合成，發現酵母菌株表現出對冷凍、干旱、氧化等耐受性的提高；Chen等[18]發現刺盤孢菌（）顯性激活的Ras（dominant activated Ras，DARas）突變體菌株表現出菌絲形態和發育異常以及凋亡樣細胞死亡，而添加脯氨酸的突變體則恢復了野生型表型，細胞內ROS被清除且細胞凋亡受到抑制。此外，脯氨酸還與真菌的生長發育密切相關，楊佳文等[19]研究發現在培養基中添加脯氨酸可以顯著促進大豆炭疽菌（）產生分生孢子。脯氨酸合成是生物體內脯氨酸大量累積的重要前提，真菌中脯氨酸的合成與細菌中脯氨酸的合成途徑大致相同[17]。在細菌和酵母中，谷氨酸在谷氨酰激酶的作用下，生成谷氨酰磷酸，谷氨酰磷酸很不穩定，在-谷氨酰磷酸還原酶（或谷氨酸-5-半醛脫氫酶）的催化下，很快生成谷氨酸半醛，谷氨酸半醛自發環化成吡咯琳-5-羧酸，后者最終被吡咯琳-5-羧酸還原酶還原成脯氨酸[20-23]。【本研究切入點】核盤菌在侵染寄主早期存在短暫的活體階段，在該階段病原菌會面臨著因寄主植物防御反應而造成的逆境，如活性氧爆發等[24-25]。已有研究表明脯氨酸能影響真菌的形態建成和發育，增強其對氧化等脅迫的耐受性。目前為止，脯氨酸合成相關基因是否參與核盤菌的致病過程還不清楚。本研究前期利用RNA-seq技術構建了核盤菌侵染時期的表達譜，發現基因SS1G_08171在侵染寄主初期表達量顯著升高，保守結構域分析發現其含有-谷氨酰磷酸還原酶（gamma-glutamyl phosphate reductase，GPR）結構域，同源性比對發現其編碼的蛋白與多種真菌中的-谷氨酰磷酸還原酶高度同源，故將其命名為，到目前為止關于的特性和功能還不清楚。【擬解決的關鍵問題】通過基因沉默的方式對進行研究，為深入揭示核盤菌的生長發育和致病機理打下基礎，并為菌核病的綠色防控提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2014—2017年在西南大學真菌病害研究實驗室完成。

1.1 試驗材料

供試菌株為核盤菌野生型菌株1980，置于PDA培養基斜面中4℃條件下保存，20℃培養箱中培養。

RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司TRNzol總RNA提取試劑。反轉錄采用Thermo Scientific公司ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，熒光定量PCR采用TOYOBO公司THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix。DNA純化采用天根（同上）通用型DNA純化回收試劑盒。質粒提取采用天根（同上）質粒小提試劑盒。PCR引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 SsGPR1生物信息學分析

通過NCBI網站檢索獲得核盤菌基因序列（SS1G_08171，登錄號：EDN92308.1）及編碼蛋白序列（登錄號：XP_001590431.1），蛋白同源性比對采用BLASTp在線軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi），氨基酸結構域分析采用NCBI Conserved Domain Database在線軟件（https://www.ncbi.nlm. nih.gov），采用MEGA 5.0軟件按照鄰近相似法構建蛋白系統發育樹。

1.3 SsGPR1表達分析

將活化好的核盤菌野生型菌株接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上，倒置于20℃培養箱培養，分別收集菌絲生長時期、菌核形成初期、菌核發育時期和菌核成熟時期的樣品；將經過一段時間低溫處理的菌核埋入高溫滅菌的河沙中，16℃誘導萌發并收集菌核萌發時期樣品。同時將野生型菌株置于鋪有玻璃紙的PDA培養基中培養2 d，研缽磨碎收集的新鮮菌絲，利用噴壺噴施擬南芥葉片，分別收集0、3、6、9和12 h的葉片。

利用TRIzol總RNA提取試劑提取樣品總RNA，ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據核盤菌的mRNA序列，設計實時熒光PCR引物RT-Gpr1fp和RT-Gpr1rp（表1），以合成的cDNA為模板，核盤菌（SS1G_04652）為內參[26]，進行實時熒光RT-PCR擴增，試驗重復3次。擴增反應體系：2×SYBR Green real-time PCR Master Mix 10 μL，正/反向引物各0.2 μmol·L-1，cDNA模板50 ng，總體積20 μL。反應程序：95℃ 2 min（1個循環）；95℃ 20 s，56℃ 15 s，72℃ 20 s（40個循環）。

表1 本研究所用引物

1.4 SsGPR1基因沉默載體的構建

為構建基因沉默載體，以核盤菌cDNA為模板，根據基因序列設計引物SiGPR1fp和SiGPR1rp（表1）進行擴增。PCR反應體系：10×Taq Buffer 5 μL，SiGPR1fp、SiGPR1rp引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，無菌水37.5 μL，總體積50 μL。PCR反應程序：預變性 95℃ 3 min；變性95℃ 30 s；退火55℃ 40 s；延伸72℃ 30 s；32個循環；終延伸72℃ 10 min。

將上述PCR產物用Ⅰ、d Ⅲ雙酶切，回收后連接到相同酶切的pCIT載體[27]上，雙酶切檢測連接成功的質粒命名為pCIT1；采用同樣方法用Ⅰ、HⅠ雙酶切上述PCR產物，將所得片段連接至相同酶切的pCIT1載體上，將連接成功后的質粒命名為pCIT2；將潮霉素磷酸轉移酶基因片段連接到pCIT2的Ⅰ酶切位點上，最終的載體命名為pSIGPR1。

1.5 SsGPR1基因沉默轉化子的獲取

按照文獻[24]的方法制備原生質體，將pSIGPR1質粒通過PEG介導轉化核盤菌野生型菌株原生質體。將挑出的轉化子連續培養3代后，提取各轉化子總RNA，用ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板，以為內參基因進行實時熒光RT-PCR擴增，試驗重復3次，擴增反應體系同前。

1.6 SsGPR1基因沉默轉化子形態特征觀察

將菌株于PDA培養基上活化后打取直徑為6 mm的菌絲塊接種至PDA平板中央，20℃培養24 h后于光學顯微鏡下觀察菌絲尖端，每個轉化子3次重復，每隔12 h以十字交叉法測定菌落直徑并計算菌絲生長速度。

同樣打取直徑為6 mm的菌絲塊接種至PDA平板中央，每個轉化子重復3次，將平板倒置于20℃培養箱中培養30 d后，收集菌核于室溫下晾干，稱取菌核質量并記錄菌核數量。將收集的菌核消毒后半埋于濕潤的河沙中，置于16℃條件下誘導萌發，觀察并記錄菌核的子囊盤萌發表型。

1.7 SsGPR1基因沉默轉化子在氧化脅迫下的生長抑制率測定

以野生型菌株為對照，在沉默轉化子菌落邊緣打取直徑6 mm的菌絲塊，分別接種至MM培養基和含有5 mmol·L-1H2O2的MM培養基平板中央，根據十字交叉法每12 h測定菌落直徑，計算72 h時菌絲的生長抑制率。

1.8 SsGPR1基因沉默轉化子的致病力測定

在活化好的野生型及沉默轉化子菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌絲塊，菌絲面朝下接種到幼嫩的油菜（中油821）葉片靠近主脈的部位，每個葉片接種1個菌絲塊，每個菌株3個重復，將接種后的植株在20℃培養箱中保濕培養，24 h后觀察并拍照記錄葉片發病情況。同時將菌絲塊接種于擬南芥（Col-0）葉片上，每株挑取3片不相鄰葉片接種，每個轉化子接種3株，48 h后觀察并拍照記錄葉片發病情況。

1.9 SsGPR1基因沉默轉化子游離脯氨酸含量的測定

參照朱廣廉等[28]對植物體內游離脯氨酸測定的方法進行脯氨酸標準曲線的制作，并對核盤菌中的游離脯氨酸進行提取，具體步驟：分別稱取野生型及沉默轉化子菌絲各0.5 g（每個菌株重復3次以上），置于試管中，向試管中加入5 ml的磺基水楊酸溶液（3%），沸水浴（10 min）后冷卻并過濾，得到游離脯氨酸的提取液。分別取2 ml的提取液，加入2 ml冰醋酸和2 ml酸性茚三酮溶液（2.5%），沸水浴30 min，冷卻后加入4 ml甲苯，搖蕩30 s，吸取上層溶液于離心管中，離心機離心5 min（3 000 r/min）。將離心后的溶液置于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520 mm波長處測定吸光度（A）值并計算每克菌絲中相應游離脯氨酸含量。

2 結果

2.1 SsGPR1生物信息學分析

開放閱讀框全長1 350 bp，編碼449個氨基酸。保守結構域分析發現SsGPR1在氨基酸H10-N426（E=0）處含有-谷氨酰磷酸還原酶（GPR）結構域。在NCBI數據庫上進行蛋白同源比對，發現SsGPR1的同源蛋白存在于許多真菌中，如灰葡萄孢（）、白霉病菌（）、白色綠僵菌（）、稻曲病菌（）、禾谷鐮孢（）等（圖1），其中相似性最高的為灰葡萄孢BC1G_13183蛋白（XP001548140.1）和白霉病菌SBOR_2215蛋白（ESZ97387.1），氨基酸序列一致性分別為95%和94%。

2.2 SsGPR1在核盤菌生長發育和致病時期的表達模式

利用實時熒光RT-PCR檢測在核盤菌野生型菌株不同發育階段的表達，結果如圖2所示，在菌絲生長時期的表達量較高，在菌核不同發育階段表達量相近，但與菌絲生長時期相比，表達量均顯著性降低。將野生型菌株接種至擬南芥植株上，并對接種后0、3、6、9 和12 h 的表達量進行分析，如圖3所示，該基因在致病過程表達水平不斷提高，且在接種9 h后表達量最高。

黑點表示核盤菌SsGPR1蛋白位置The black spot indicates the position of S. sclerotiorum SsGPR1 protein

柱上不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同Different lowercases on column mean significantly different (P＜0.05). The same as below

2.3 SsGPR1基因沉默轉化子鑒定

利用PEG介導的原生質體轉化方法將pSIGPR1轉入到核盤菌野生型菌株中，并利用實時熒光RT-PCR檢測不同轉化子中的表達水平，結果表明，菌株SiGPR1-104和SiGPR1-149中的表達水平與野生型相比顯著下降（圖4），故將這兩個菌株作為研究對象。

圖3 SsGPR1在核盤菌致病過程中的表達

圖4 SsGPR1基因沉默轉化子中SsGPR1的表達

2.4 SsGPR1基因沉默轉化子形態特征

在光學顯微鏡下分別觀察核盤菌野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149的菌絲形態，與野生型菌株相比，基因沉默轉化子菌落邊緣菌絲較稠密（圖5）。對沉默轉化子生長速度進行測定，結果表明沉默轉化子生長速度顯著降低（圖6）。在PDA培養基上培養30 d后，基因沉默轉化子菌核形成數量（圖7）及干重（圖8）與野生型菌株無顯著性差異。通過在室內誘導菌核萌發表明沉默轉化子形成的菌核均能萌發形成子囊盤，表明與菌核形成及萌發無關。

2.5 SsGPR1基因沉默轉化子在氧化脅迫下的生長

將野生型菌株和SiGPR1-104、SiGPR1-149分別接種于添加了5 mmol·L-1H2O2的MM培養基中培養，測定其菌落直徑并計算菌絲生長抑制率。如圖9所示，與野生型菌株相比，沉默轉化子在含有H2O2的培養基中菌絲生長受到更強的抑制（圖9），表明基因沉默轉化子對氧化脅迫更加敏感。

圖5 SsGPR1基因沉默轉化子菌絲形態

圖6 SsGPR1基因沉默轉化子生長速度

圖7 SsGPR1基因沉默轉化子菌核數量

圖8 SsGPR1基因沉默轉化子菌核干重

圖9 SsGPR1基因沉默轉化子在氧化脅迫下的生長抑制率

2.6 SsGPR1基因沉默轉化子致病力分析

將野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149分別接種到活體擬南芥植株和活體油菜葉片上，結果表明與野生型菌株相比，SiGPR1-104和SiGPR1-149在油菜和擬南芥葉片上致病力減弱（圖10），病斑直徑顯著下降（圖11），表明與核盤菌致病力密切相關。

圖10 SsGPR1基因沉默轉化子致病力測定

圖11 SsGPR1基因沉默轉化子病斑直徑

2.7 SsGPR1基因沉默轉化子的游離脯氨酸含量

利用茚三酮法對野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149菌絲中游離脯氨酸含量進行了測定，結果顯示基因沉默轉化子與野生型菌株菌絲中的游離脯氨酸含量無顯著差異（圖12），均在0.175—0.178 μg·g-1，表明與核盤菌游離脯氨酸的含量無關。

圖12 SsGPR1基因沉默轉化子游離脯氨酸含量

3 討論

本研究發現核盤菌基因編碼一個-谷氨酰磷酸還原酶同源蛋白，該基因在核盤菌菌絲生長時期及致病初期表達顯著上調，基因沉默轉化子生長速度降低，菌絲稠密，致病力下降以及對氧化脅迫更加敏感，但菌核形成及萌發表現正常。

由于-谷氨酰磷酸還原酶催化脯氨酸生物合成的第二步[12-15]，為明確在核盤菌脯氨酸合成中的作用，本研究比較了野生型菌株和基因沉默菌株之間的脯氨酸積累量，結果卻表明在基因沉默菌株的脯氨酸含量與野生型菌株并無顯著差異。唐亮[29]研究釀酒酵母谷胱甘肽（GSH）合成途徑時發現，除-谷氨酰半胱氨酸合成酶（Gsh1）和谷胱甘肽合成酶（Gsh2）兩個合成途徑外，還存在一條谷胱甘肽合成的替代途徑，即通過參與脯氨酸生物合成的第一個功能蛋白酶-谷氨酰激酶（GK）的功能來實現對Gsh1的替代作用，是谷胱甘肽合成的第3條途徑。筆者推測，當基因沉默導致脯氨酸合成受到抑制時，該替代途徑可能向脯氨酸合成偏移，從而彌補脯氨酸的合成，使脯氨酸的合成相對穩定，而谷胱甘肽的合成是否會產生影響有待于進一步研究。

在致病初期表達量逐步升高，且基因沉默菌株在油菜和擬南芥上的致病力顯著下降，表明參與調控了核盤菌的致病性，但對于其作用機理仍不清楚。核盤菌在侵染初期會激發寄主植物的活性氧爆發，而活性氧能幫助寄主抵御病原菌的侵入[25,30]，Xu等[24]通過T-DNA插入突變發現核盤菌超氧化物歧化酶基因與病原菌抵抗氧化壓力和致病力密切相關；Yu等[31]將核盤菌Bax抑制子基因沉默后發現，基因沉默轉化子對活性氧更加敏感，且致病力顯著下降。這些研究均表明，核盤菌抵御氧化脅迫的能力與其致病性有著密切聯系，本研究發現基因沉默菌株對于氧化脅迫更加敏感，推測基因沉默菌株致病力減弱與其抵御活性氧能力下降有關，而后者可能受到谷胱甘肽含量變化的影響，谷胱甘肽具備抗氧化的特點，作為重要的抗氧化劑和自由基清除劑[32-33]，在核盤菌侵染過程中，谷胱甘肽可以幫助抵御植物活性氧迸發，從而有利于其侵染[34]。

4 結論

核盤菌基因編碼一個-谷氨酰磷酸還原酶同源蛋白，該基因與核盤菌菌絲形態和生長密切相關，且參與病原菌氧化脅迫和致病過程。

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（責任編輯 岳梅）

Function analysis of-glutamyl phosphate reductase-encoded gene

DU Jiao, WANG YaBo, Li Xuehua, Huang Zhiqiang, YANG Yuheng, BI Chaowei, YU Yang

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】The gamma-glutamyl phosphate reductase (GPR) is a key enzyme in fungal proline synthesis pathway. The objective of this study is to silence a GPR-encoded genevia the RNA interference strategy, research the mycelial growth, sclerotial formation and pathogenicity of the gene-silencing transformants, so as to lay a foundation for revealing the growth, development and pathogenicity of. It also provides important clues for the green prevention and control of Sclerotinia disease.【Method】Homology analysis and phylogenetic tree construction were performed through the BLAST search and MEGA 5.0 software. The real-time RT-PCR was used to detect the expression pattern ofat the different stages of mycelial growth, sclerotial development and germination, and infection processes. The gene silencing vector ofwas constructed based on the principle of RNA interference, and the vector was used to transform wild-type strain 1980 by PEG-mediated transformation of protoplasts methods. The gene-silenced strains were identified by real-time RT-PCR. The mycelial morphology, growth rate and sclerotial formation of the gene-silenced strains were observed and the hyphal growth rate under the oxidative stress was measured. The gene-silenced strains were inoculated onleaves andplants, and lesion size was observed and measured. The free proline of gene-silenced strains was assayed using the acid ninhydrin method. 【Result】ofis 1 454 bp in length and encodes 449 amino acids. SsGPR1 protein contains a GPR domain at amino acid H10-N426. SsGPR1 showed high sequence similarity withBC1G_13183 (95% identities) andSBOR_2215 protein (94% identities). The three proteins clustered into a small branch according to the result of phylogenetic tree.showed high expression level during hyphae growth. The expression level was similar during the different development stages of sclerotia, but it significantly decreased compared with that during the hyphal growth period. The expression level ofincreased gradually during the pathogenic period, and it reached the highest at 9 h post inoculation. Thesilencing vector, pSIGPR1 was transformed into the wild-type strain of, and the expression level ofgene-silenced transformants. When cultured on PDA medium,gene-silenced strains had no significant difference with wild-type strain on the number and average dry weight of sclerotia, which can germinate to form apothecium. However, the gene-silenced strains produced denser hyphae and showed a significantly reduce in growth rate. The hyphal growth ofgene-silenced strains was inhibited more strongly when cultured on medium containing H2O2, indicating that the gene-silenced strains were more sensitive to oxidative stress.gene-silenced strains led to small lesions onleaves andplants, indicating that the pathogenicity of the gene-silenced strains was impaired. The content of proline produced bygene-silenced strains had no significant difference with wild-type strain.【Conclusion】is related to hyphal growth and mycelial morphology, and involved in the oxidative stress resistance and pathogenicity of.

; proline; gamma-glutamyl phosphate reductase; gene silencing; pathogenicity; oxidative stress

2018-04-21；

2018-05-28

國家重點研發計劃（2018YFD0200903）、重慶市基礎與前沿研究一般項目（cstc2017jcyjAX0096）、中央高校基本科研業務費“創新團隊”專項（XDJK2017A006，XDJK2018AA004）

杜嬌，E-mail：296532280@qq.com。 通信作者余洋，E-mail：zbyuyang@swu.edu.cn。通信作者畢朝位，E-mail：chwbi2073@sina.com