四倍體西瓜抗枯萎病菌生理小種1的機理

姬萬麗，朱紅菊，路緒強，趙勝杰，何楠，耿麗華，劉文革

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四倍體西瓜抗枯萎病菌生理小種1的機理

姬萬麗1，朱紅菊1，路緒強1，趙勝杰1，何楠1，耿麗華2，劉文革1

（1中國農業科學院鄭州果樹研究所國家瓜果改良中心，鄭州 450009；2國家蔬菜工程技術研究中心，北京 100097）

【目的】近年來由于西瓜重茬種植面積的不斷增加及連作障礙的發生導致枯萎病在西瓜上迅速蔓延，該病害已經成為限制西瓜生產的主要因素之一。田間觀察發現四倍體西瓜比其同源二倍體西瓜抗枯萎病。本研究通過對比四倍體與二倍體抗性差異，揭示四倍體西瓜抗枯萎病的機理，為西瓜多倍體育種和抗病育種提供理論依據。【方法】以同基因型的鄭州3號二倍體和四倍體西瓜幼苗為材料，在一葉一心時期接種枯萎病菌生理小種1（f. sprace 1，Fon 1），比較不同倍性西瓜苗期枯萎病抗性差異；運用綠色熒光蛋白標記技術觀察枯萎病菌的侵染過程；并分析過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、丙二醛（MDA）、總酚及類黃酮等與抗病相關代謝物質活性/含量差異，及基因表達變化。【結果】西瓜苗期接種枯萎病菌后，二倍體西瓜幼苗4 d發病，10 d時大部分枯死；四倍體西瓜幼苗7 d開始發病，13 d時大部分枯死，四倍體相對其同源二倍體延后3 d發病。枯萎病菌侵染過程對比發現，病菌在二倍體和四倍體西瓜中的侵染路徑相同；此外不同倍性西瓜根系分生孢子的萌發率無明顯差別，但是隨著病菌的侵染，枯萎病菌在四倍體幼苗中的侵染速度明顯較慢，細胞間菌絲較少；枯萎病菌在四倍體西瓜幼苗維管束中的定殖率比其同源二倍體低，且在幼苗根部差異顯著、葉柄部差異極顯著，病菌在四倍體植株莖部及葉部的擴展得到了一定的限制；枯萎病菌在四倍體西瓜中的侵染過程明顯滯后，與枯萎病的發病癥狀相吻合。接種枯萎病菌后，四倍體西瓜幼苗根系POD、PAL活性均呈增加的趨勢，且四倍體幼苗根系POD活性增加的幅度比二倍體大，病菌侵染后四倍體根系生成了更多的PAL和POD以增強植物抗病能力，保護細胞免受傷害；四倍體西瓜根系中總酚、類黃酮含量的增加量明顯高于同源二倍體，這些次生代謝物質含量的優勢，使得四倍體植株更易于抵御枯萎病菌的入侵；另外四倍體西瓜根系MDA含量明顯比同時期的二倍體低，表明接種枯萎病菌后四倍體西瓜幼苗根系細胞膜損傷程度更小。抗病基因的表達分析發現，接種枯萎病菌后四倍體的表達量不斷增加，在接種后10 d表達量達到最大，是二倍體同時期表達量的10倍；接種后期四倍體根系能表達更多的，傳遞抗病信號，促進抗病基因的表達，從而降低枯萎病菌對西瓜幼苗的傷害；的表達量呈現先增高后降低的趨勢，表達量均高于同時期的二倍體幼苗，最大表達量是二倍體表達量的6倍；四倍體的表達量明顯高于其同源二倍體，接種后7、10 d四倍體根系的表達量分別是二倍體的80、35倍。【結論】通過苗期枯萎病菌接種鑒定、病菌侵染過程觀察、代謝物質含量及基因表達水平變化等多方面的研究，表明四倍體西瓜幼苗比同源二倍體抗枯萎病。

西瓜；四倍體；枯萎病菌生理小種1（Fon 1）；抗性機理

0 引言

【研究意義】我國是西瓜（）產業大國，種植面積183萬公頃，占世界西瓜種植面積的60%，總產量的73%[1]。由于近年來我國西瓜種植產業的調整，溫室及大棚栽培的面積不斷增加，農戶的種植方式單一化，西瓜重茬栽培比較普遍，導致西瓜枯萎病的發病情況有逐年加重趨勢，尤其在西瓜主產區發病更為嚴重。西瓜枯萎病是由尖鐮孢西瓜專化型（f. sp.，Fon）侵染植株根部維管束引起的一類土傳病害，該病菌可以在土壤中存活十年以上，而且小種也會不斷發生變異，防治比較困難，西瓜枯萎病已嚴重影響西瓜產業的發展。因此選育抗枯萎病的西瓜品種對于西瓜產業的發展具有重要意義，特別是多倍體西瓜抗病育種為解決西瓜枯萎病的難題提供了新思路。【前人研究進展】多倍體化是植物物種形成及基因組進化的一種重要的機制[2]，幾乎所有的植物在進化過程中都至少有一次或伴隨著多次基因組的加倍[3]；前人研究發現多倍體與它們的同源二倍體祖先相比具有更高的抗病能力，劉文革等[4]對不同染色體倍性的西瓜枯萎病抗病性進行了研究，結果顯示同源四倍體及同源三倍體對枯萎病的抗病能力均優于其同源二倍體，可連種多茬；二倍體獼猴桃（）植株在接種潰瘍病菌（pv）后3 d內感病，四倍體植株在接種病菌后5 d感病，四倍體植株中過氧化物酶（POD）及超氧化物歧化SOD活性均高于同源二倍體，一定程度上說明同源四倍體的抗病性強于二倍體[5]；Wei等[6]研究發現，至少有44%的同源加倍區域的基因參與了四倍體甘藍型油菜（）對莖部潰瘍病的抗性；接著FOMEJU等[7]發現甘藍型油菜四倍體對莖部潰瘍病的抗性強于其二倍體。染色體加倍后，四倍體大蕉（spp）比二倍體表現出更高的葉斑病抗性[8]；上述研究表明，與二倍體相比多倍體在抗病方面表現出一定的優勢。徐錦華等[9]對51份四倍體西瓜材料進行了枯萎病抗病性評價，通過對二倍體和四倍體雜交配制的三倍體無籽西瓜研究發現，三倍體西瓜枯萎病抗性主要源于四倍體母本的加性遺傳而非二倍體父本的加性遺傳；焦荻等[10]將枯萎病菌基因Fon-1緊密連鎖的Caps標記應用到了四倍體西瓜抗病育種篩選中，得到了純合的抗枯萎病四倍體材料，同時發現抗病基因雜合位點對應的枯萎病抗性順序依次為：三顯體＞二顯體＞單顯體。枯萎病菌侵染寄主后，寄主可對枯萎病菌的侵染產生一定的生理反應，并通過表皮角質層等組織結構抵御病原菌的進一步入侵，程玉瑾等[11]發現西瓜接種枯萎病菌后，感病品種根系薄壁細胞間菌絲比抗病品種的多、侵染速度相對較快。通過綠色熒光蛋白（GFP）標記枯萎病菌的方法，可以直觀、便捷的觀察病菌在植物體內的侵染動態，Zvirin等[12-13]分別用GFP標記技術觀察了枯萎病菌在甜瓜上的侵染過程；Lü等[14]首次將GFP標記導入西瓜枯萎病菌，通過熒光觀察其在根系的侵染過程，結果顯示抗病品種的主根中再生孢子不再萌發，表現為抗定殖，而不抗侵染；寄主對枯萎病菌的侵染過程反應是多方面的，植物在脅迫條件下的反應首先是初級代謝的改變，植物感病后能產生一些對病菌有抑制作用的物質，例如酚類化合物、木質素、類黃酮和抗病相關蛋白等，病原菌侵染后會自動開啟和增加體內抗病相關基因的表達，并生成與抗病相關的產物，進而表現出不同程度的植物免疫性和抗病性反應[15]；Lü等[16]初步利用自定義基因芯片，分析了西瓜與枯萎病菌非親和互作的基因表達情況，發現接種病菌后不同時間內西瓜根系基因差異表達顯著；Yang等[17]對接種枯萎病菌后的西瓜幼苗進行熒光定量檢測，結果顯示基因在接種12 h后表達量達到最大；李猷等[18]以卡紅為抗病實驗材料進行了表達譜分析，結果顯示抗枯萎病菌生理小種1的相關基因主要涉及抗病信號傳導、轉錄因子、抗病防衛、細胞保護和次生代謝合成等方面。總之，寄主植物的抗病反應是個十分復雜的系統，其中包含了各種信號傳遞及寄主植物在外觀形態、細胞組織、生理生化、分子等水平變化的過程，僅研究某一水平、某一時期的互作機理是不夠的，應該綜合運用各種手段進行系統研究，從不同層面揭示西瓜與枯萎病菌相互作用的機理。【本研究切入點】對西瓜抗枯萎病的研究主要集中于二倍體西瓜細胞組織結構、生理生化變化和分子標記，但針對于多倍體西瓜抗枯萎病的研究并不多，關于四倍體西瓜抗枯萎病機理的研究還未見報道。【擬解決的關鍵問題】以二倍體及人工誘導的同基因型四倍體西瓜為材料，通過鑒定不同倍性西瓜材料的枯萎病抗性，比較枯萎病菌在不同倍性材料中侵染過程的變化、接種病菌前后不同時期與抗病有關的代謝物質含量變化以及基因表達差異，尋找與抗病有關的差異變化，從生理結構、代謝物含量和抗病基因表達等多層面闡明四倍體西瓜枯萎病抗性的機理，為多倍體西瓜抗病育種提供新的理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017年在中國農業科學院鄭州果樹研究所完成。

1.1 試驗材料

本研究所用的試驗材料為鄭州3號二倍體及同源四倍體西瓜，抗病對照品種為Sugarlee。帶GFP標記的枯萎病菌生理小種1（Fon 1）由北京市農林科學院蔬菜研究中心許勇研究員惠贈。

鄭州3號二倍體西瓜是中國農業科學院鄭州果樹研究所選育的中果型西瓜品種，該品種中熟，果實圓形具淺綠網紋，果肉紅色，種子黃色具淺褐斑。鄭州3號四倍體于2006年由多倍體西瓜遺傳育種課題組在中牟試驗基地用0.2%的秋水仙素誘導幼苗生長點獲得，之后連續自交6代，孕性恢復，性狀穩定。

1.2 西瓜幼苗的培養

挑選均勻一致的西瓜種子進行人工破殼，于55℃溫湯浸種2 h后，用濕毛巾包好，放置在30℃培養箱中培養24 h，取出發芽整齊的種子播種至已經澆透水的育苗專用基質中，覆土并覆膜保濕，待80%幼苗破土后，去膜適當通風，并及時進行脫帽。西瓜幼苗的培養在中國農業科學院鄭州果樹研究所智能型溫室中進行，幼苗生長環境為相對濕度50%、溫度28℃、16 h/8 h光暗交替。

1.3 傷根法接種

西瓜苗生長至一葉一心時，選取生長一致的幼苗，用傷根法接種枯萎病菌[19]。將幼苗輕輕從基質中拔出并用清水洗凈根表，此過程盡量不要傷害植物根系；用消毒過的剪刀剪去根長的1/3；置于濃度為106個/ml分生孢子懸液中浸根15 min；移栽至新的培養基質中，繼續用不少于40 ml的分生孢子懸液灌根處理；覆膜保濕3 d，之后放置在28℃的環境中生長。

1.4 枯萎病發病統計

自發病之日起記錄發病情況，并統計發病等級。等級的劃分參照Elmstrom等[20]的標準并稍作改動，具體如下：0級，無明顯發病癥狀，與對照幼苗無差異；1級，植株葉片出現黃化，子葉和葉片輕微萎蔫；2級，一片真葉萎蔫或子葉嚴重萎蔫；3級，子葉及60%以上真葉萎蔫，不能恢復正常；4級，整株萎蔫，60%以上枯死，但心葉仍成活；5級，整株枯死。

病情指數=（∑（病情等級×該病情等級下幼苗株數）×100）/（5×調查總株數）

試驗以Sugarlee為抗病對照品種，對鄭州3號二倍體及同源四倍體進行苗期枯萎病接種鑒定，每一組材料重復鑒定3次，每重復鑒定設置30株。

1.5 侵染過程觀察

選取接種枯萎病菌后不同時期（0.25、1、2、4、7、10 d）的西瓜幼苗，將植株輕輕從營養缽中取出，沖洗干凈根系的基質，此過程盡量要保證根系的完整。將清洗好的西瓜根系及莖葉部分放置在操作臺上，選取要觀察的部分經過制片處理后，倒置放在顯微鏡下觀察枯萎病菌在西瓜植株內部的侵染情況及幼苗組織結構變化。激光共聚焦顯微鏡的型號為Leica TCS SP5，激發光波長為488 nm，在發射光譜505—525 nm范圍內，綠色熒光條件下觀察病菌的侵染過程，保存激光和明場的實驗照片，并存檔。

定殖率是指枯萎病菌在西瓜幼苗根莖及葉柄維管束中的定殖比例。每個時期的二倍體、四倍體幼苗分別取6株重復觀察，根、莖、葉等每個部位5個樣品，共30個重復，設每次觀察的定殖率的值為a%。病菌在幼苗不同部位維管束中最終的定殖率=（a1%+a2%+…+a30%）×100/30。

1.6 與抗病相關代謝物含量的測定

接種后分別取0、1、4、7、10 d的西瓜根系樣品，用清水將幼苗的整個根系清洗干凈，吸干表面水分。用消過毒的剪刀將全部的根系剪成根段，在天平上稱取0.1 g新鮮組織，裝入2 ml的離心管中，液氮速凍，之后放入-80℃冰箱保存，用于丙二醛（MDA）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）含量/活性的測定；總酚和類黃酮的樣品預處理，是將清洗干凈的西瓜根系放入80℃烘箱，烘干至質量不再發生變化，在研缽中研成粉末狀，過40目篩子后，放在干燥的環境中待用。樣品均由6株幼苗的全部根系混合后得到，每個樣品3次重復。

MDA、POD、PAL、總酚、類黃酮含量/活性的測定方法均按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。POD以每克組織在每毫升反應體系中每分鐘使470 nm下吸光值變化0.01為一個酶活力單位；PAL以每克組織每毫升反應體系中每分鐘使290 nm下吸光值變化0.1為一個酶活力單位。

1.7 基因表達量的測定

接種后分別取0、1、4、7、10 d的西瓜根系樣品，用于基因表達量的測定。RNA提取及反轉錄的步驟均按照試劑盒（EasyPure Plant RNA Kit，TRANS；PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），TaKaRa）的說明書進行。實時熒光定量反應在Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行，以基因為內參[21]，對接種病菌后不同倍性西瓜、、、的表達量進行測定。

每次測定樣品和內參均做3次重復，基因的表達量按照2-ΔΔCT法進行分析[22]。以每個基因中最低的表達量數值為1，計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

2 結果

2.1 不同倍性西瓜枯萎病苗期鑒定

依據劃分的抗病等級，統計接種生理小種1后不同時期西瓜苗的發病情況，計算不同品種的病情指數，結果如表2所示。接種枯萎病菌前3 d是覆膜保濕階段，未見有明顯的萎蔫情況。接種后4 d：鄭州3號二倍體開始發病，大部分子葉和真葉萎蔫，發病等級集中在2—3級，病情指數為53.3；四倍體子葉或真葉輕微萎蔫，早晚尚可恢復，發病癥狀集中在0—2級，病情指數為17.1。接種后7 d：二倍體整株嚴重萎蔫（圖1右），發病等級集中在4級，病情指數75.2；四倍體子葉萎蔫黃化，部分真葉萎蔫（圖1左），發病等級集中在2—3級，病情指數為49.5。接種后10 d：二倍體80%以上枯死，發病等級4—5級，病情指數為91.4；四倍體60%以上真葉萎蔫，部分植株萎蔫嚴重，發病等級3—4級，病情指數為66.7。

表1 實時熒光定量引物

表2 接種枯萎病菌生理小種1后二倍體及其同源四倍體病情指數

R表示枯萎病抗病品種R stands for the cultivar that resistant to Fusarium wilt disease

鑒定結果顯示，與枯萎病抗性鑒定對照Sugarlee相比，鄭州3號二倍體和同源四倍體西瓜感病，但與二倍體相比，四倍體幼苗枯萎病的發病癥狀明顯延遲。二倍體西瓜幼苗接種后4 d發病，10 d時大部分枯死；四倍體西瓜幼苗接種后7 d開始發病，13 d時大部分枯死；四倍體比二倍體延遲3 d感病；在一定程度上說明四倍體相對于其同源二倍體抗枯萎病。

圖1 鄭州3號二倍體及其同源四倍體接種枯萎病菌生理小種1后第7天發病情況對比

2.2 枯萎病菌在不同倍性西瓜中侵染過程的觀察

2.2.1 枯萎病菌在二倍體西瓜根系中的侵染過程觀察 接種后0.25 d，分生孢子附著在根系表面，部分孢子已經萌發形成芽管，并開始侵入植物根系角質層；大量的觀察發現，根毛部位的熒光較強，可能是因為根毛部位凸起的結構，更有利于真菌的黏附（圖2-A）。接種后1 d，芽管不斷地生長分化形成纖細的菌絲；菌絲穿過根部角質層及表皮細胞的保護，并沿著皮層薄壁細胞間隙不斷的擴展延伸（圖2-B）；少量的菌絲已經到達維管束周圍的薄壁細胞及部分側根的維管束，圖2-C可以觀察到枯萎病菌在少部分根系維管束中擴展，其中主根和側根的交匯處是比較易入侵的部位。接種后2 d，菌絲在根系大量繁殖，并在根系細胞間隙不斷的生長，將整個細胞團團圍住，逐漸形成了大量的空間網狀結構（圖2-D）；到達維管束的病原菌菌絲沿著導管內部管壁快速生長，并不斷形成新的分枝，根系維管束可以觀察到明顯的分生菌絲（圖2-E，箭頭所示為分生的菌絲）。接種后4 d，維管束中定殖的菌絲除了沿管壁生長外，還可以通過導管間的紋孔在根系維管束細胞間傳遞橫向傳遞；螺紋、網紋等不同分化程度的導管間均可以觀察到菌絲的存在（圖2-F）；此時約半數的根系維管束已經被病菌侵染，有的二級、三級側根已經開始褐化變軟；在莖中下部的導管中也可以觀察到少量的侵染性菌絲（圖2-G）。接種后7 d，幾乎所有的根系已被菌絲入侵，根系嚴重褐化，組織結構開始瓦解；莖葉部橫切發現，莖部被大量菌絲侵染，病原菌大量入侵莖部的薄壁細胞、導管細胞壁熒光明顯增強（圖2-H）；葉柄部位也可以觀察到菌絲存在（圖2-I）；此時二倍體西瓜幼苗葉片已經嚴重萎蔫并逐漸枯萎。接種后10 d，二倍體80%以上幼苗已經枯死；根部侵染的菌絲產生了大量的厚垣孢子（圖2-J）；根系嚴重褐化變軟，已經看不清根系的組織結構；莖部維管束內的菌絲已經嚴重堵塞了導管的管腔（圖2-K），薄壁細胞中的分生菌絲清晰可見（圖2-L）。

2.2.2 枯萎病菌在四倍體西瓜根系中的侵染過程觀察 接種后0.25 d，大部分的孢子已經萌發形成芽管，在根系周圍大量富集，并附著在根系表面（圖3-A），與二倍體無明顯差異。接種后1 d，孢子萌發后通過不同的方式入侵西瓜根部，穿過角質層及表皮細胞，分化形成的菌絲體在表皮細胞間擴展延伸；與二倍體相比此時病菌僅侵染了四倍體西瓜根系1—3層表皮細胞（圖3-B），且維管束中尚未觀察到枯萎病菌的定殖現象。接種后2 d，在顯微鏡下可以觀察到根系表皮被綠色熒光的菌所覆蓋；菌絲入侵表皮細胞后，繼續向皮層薄壁組織細胞間隙延伸，在部分區域的細胞周圍形成網狀結構（圖3-C）；根系木質部觀察到有少量的病菌侵染（圖3-D）；此時與二倍體相比根系細胞間隙的菌絲更少。接種后4 d，菌絲體已經大量侵染表皮細胞；深入根系維管束組織，并在導管中迅速延伸（圖3-E）；莖部導管還未觀察到有枯萎病菌的定殖現象。接種后7 d，四倍體西瓜幼苗子葉萎蔫黃化，部分真葉萎蔫；顯微鏡觀察發現主根和大部分側根的維管束均已經被菌絲入侵；菌絲隨液流向上運輸到達莖部維管束（圖3-F）；且葉柄部橫切后，維管束內也觀察到少量的菌絲存在（圖3-G）；雖然根莖葉維管束中均有病菌的侵染，但莖葉部病菌侵染定殖的程度較輕，除此之外新萌發的側根并未被侵染。接種后10 d，四倍體大部分真葉已經萎蔫；菌絲已經占滿了整個根系，導管細胞已經被菌絲填滿（圖3-H），組織結構開始瓦解，此時四倍體西瓜根系未觀察到厚垣孢子的產生；莖部雖受維管束侵染，菌絲僅沿著導管壁生長，但并未完全堵塞導管（圖3-I）。

2.2.3 枯萎病菌在二倍體與四倍體維管束中定殖率的比較 比較枯萎病菌在二倍體及其同源四倍體西瓜中的侵染過程發現，枯萎病菌在不同倍性西瓜中的侵染路徑相同，但病原菌在四倍體中的侵染速度相比于二倍體明顯延后。二倍體西瓜幼苗根系接種枯萎病菌后1 d，在維管束周圍的薄壁細胞及部分側根的維管束就已經觀察到少量的病菌入侵，2 d根系維管束可以觀察到明顯的分生菌絲。而四倍體西瓜在2 d后才觀察到木質部有少量的病菌侵染，并且細胞間隙的菌絲明顯比二倍體少；圖4是接種枯萎病菌4—10 d內二倍體及四倍體幼苗維管束中枯萎病菌定殖率的比較結果。接種枯萎病菌4 d后，二倍體西瓜幼苗根系及莖的維管束均被枯萎病菌定殖，根部、下莖部、上莖部的定殖率分別為43%、30%、8%；但在四倍體中病菌的侵染只到達下部莖，上部莖維管束沒有觀察到明顯的熒光存在，定殖率為0，根部及下莖部的病菌定殖率分別為23%、9%；此時枯萎病菌在二倍體與四倍體根部維管束中的定殖率差異顯著，在下莖部差異極顯著。接種7 d后，二倍體幼苗植株大部分枯萎（圖1右），幾乎所有的根系被菌絲入侵，定殖率為100%，根系褐化，結構開始瓦解，莖葉部維管束中病菌的定殖率也已達到50%以上；而四倍體主根和大部分側根雖被菌絲入侵，但有部分新生側根未被侵染，根系維管束中病菌定殖率80%。接種后10 d，二倍體根部侵染的菌絲產生了大量的厚垣孢子，根系嚴重變褐變軟，已經看不清組織結構，莖部明顯可以觀察到分生菌絲網絡及維管束堵死現象，除葉柄部位維管束病菌的定殖率為68%外，葉柄以下部位均已達到100%；四倍體幼苗莖部雖受維管束侵染，但與二倍體同時期相比病菌僅沿導管壁生長并未完全堵塞導管，此時枯萎病菌在二倍體及四倍體下莖部維管束定殖率差異顯著，在上莖部及葉柄差異極顯著。總的來說，枯萎病菌在四倍體西瓜幼苗中的定殖率相對于其同源二倍體較低，在不同倍性幼苗根部定殖率差異顯著，在葉柄部差異極顯著，枯萎病菌在四倍體西瓜幼苗維管束中的定殖時間明顯延遲。

Xyl：植物的木質部the xylem of the plant；Par：薄壁細胞parenchyma cells

Xyl：植物的木質部the xylem of the plant

2.3 不同倍性西瓜幼苗接種枯萎病菌后POD、PAL的活性及MDA、總酚、類黃酮含量變化

MDA含量與細胞受逆境脅迫的損傷程度呈正相關。接種枯萎病菌后二倍體根系MDA含量在1 d時有所降低，之后隨著時間的推移根系MDA含量不斷增加；四倍體西瓜根系中MDA含量也呈不斷增加的趨勢。總體來看，二倍體西瓜幼苗根系MDA含量明顯比同時期的四倍體高（圖5-A），表明枯萎病菌侵染后，二倍體西瓜根系細胞膜損傷程度更大。

橫坐標表示二倍體及其同源四倍體接種后的不同時期，縱坐標表示枯萎病菌在西瓜幼苗不同部位維管束中的定殖率。*表示差異顯著（p＜0.05）；**表示差異極顯著（p＜0.01） The abscissa shows different days post inoculation in diploid and its autotetraploid, and the ordinate shows the colonization rate of Fon 1 in vascular at different tissues of watermelon seedlings. * indicates significantly different at p＜0.05 level; ** indicatessignificantly different at p＜0.01 level

接種枯萎病菌前二倍體和四倍體西瓜根系POD活性差異較小；接種病菌后二倍體及四倍體西瓜根系POD活性均呈增加的趨勢，但四倍體幼苗根系POD活性增加的幅度比二倍體大，接種枯萎病后10 d二倍體和四倍體根系POD活性分別為接種前的5.0、9.9倍（圖5-B）；四倍體根系POD活性整體高于其同源二倍體，并且在10 d時差異最為明顯。

接種處理前二倍體植物根系的PAL活性明顯比四倍體高，隨著病菌的入侵，二倍體PAL活性總體呈下降的趨勢；接種枯萎病菌后四倍體PAL活性逐漸增加在7 d時達到最高，7 d后也開始下降；與接種前相比，接種后1 d二倍體根系PAL活性降低6.2%、四倍體增加22.5%，接種后7 d二倍體根系PAL活性降低6.6%、四倍體增加95.2%，接種后10 d二倍體根系PAL活性降低73.3%、四倍體增加3.2%；病菌侵染后四倍體PAL活性的增加量明顯高于其同源二倍體（圖5-C）。

接種枯萎病菌后西瓜幼苗根系總酚的含量呈降低的趨勢，在二倍體和四倍體中變化相似；但四倍體西瓜根系中總酚含量高于其同源二倍體，在接種0、1、4、7、10 d的根系總酚含量分別比二倍體高18.6%、6.7%、1.4%、7.0%、8.4%（圖5-D）。

接種處理前，四倍體類黃酮的含量稍低于同源二倍體；隨著枯萎病菌的侵染，二倍體幼苗根系黃酮含量逐漸降低；四倍體在接種1 d后根系類黃酮含量不斷增加；與接種前相比，接種后1 d二倍體和四倍體根系類黃酮含量分別降低12.6%、11.7%，接種后4 d二倍體和四倍體根系類黃酮含量分別降低15.9%、4.2%，接種后7 d二倍體根系類黃酮含量降低22.7%、四倍體增加7.5%，接種后10 d二倍體根系類黃酮含量降低31.8%、四倍體增加19.6%；病菌侵染后四倍體類黃酮含量的增加量明顯高于其同源二倍體（圖5-E）。

圖5 不同倍性西瓜幼苗接種枯萎病菌后POD、PAL的活性及MDA、總酚、類黃酮含量變化

2.4 不同倍性西瓜接種枯萎病菌后抗枯萎病基因PR3、MPK7、PAL、MYB的表達

以基因（Cla016178）為內參，分析了接種病菌后不同倍性西瓜、、、相對表達量的變化（圖6）。接種枯萎病菌后二倍體西瓜根系的相對表達量一直處于較低水平，差異小；四倍體西瓜根系表達量隨接種后時間的推移不斷增加，在接種后10 d表達量最高，是0 d表達量的6倍；二倍體與四倍體相比，0—4 d時表達量無明顯差異；接種枯萎病菌7、10 d后四倍體西瓜根系的表達量分別是二倍體的2、10倍。

二倍體和四倍體西瓜根系呈現不同的表達趨勢，二倍體根系表達量在4 d達到最大值，為0 d對照的3倍；四倍體的表達量隨著接種后時間的推移不斷增加，10 d時的表達量為0 d對照的4倍；枯萎病菌侵染前期四倍體根系的表達量略低，在侵染后期四倍體的表達量明顯高于二倍體，接種7 d后是二倍體表達量的2倍、10 d后是二倍體表達量的3倍。

二倍體西瓜的表達量一直在14—65間波動，變化幅度不大；四倍體西瓜的表達量呈現先增高后降低的趨勢，與PAL酶活性的變化相一致；不同倍性西瓜比較發現，接種前后各時期內四倍體幼苗根系的表達量均高于二倍體，接種后4 d差別最大，是二倍體表達量的6倍，接種后7 d和10 d分別是二倍體表達量的2倍和3倍。

與四倍體相比二倍體根系表達量一直處于極低的水平，接種后7 d時表達量達到最大值僅為160；四倍體根系的表達量同樣呈現先增高后降低的趨勢，且高于同源二倍體，接種7 d時四倍體的表達量是二倍體的80倍，接種10 d后的表達量開始下降，是二倍體同時期的35倍；接種后7 d和10 d，在四倍體西瓜根系明顯上調表達。

圖6 不同倍性西瓜接種枯萎病菌后抗枯萎病基因PR3、MPK7、PAL、MYB的表達量

3 討論

3.1 不同倍性西瓜抗枯萎病苗期鑒定

多倍體化在植物的進化中具有重要的地位，正因為多倍化的頻率高及多倍體的抗逆性，使得遺傳穩定的多倍體能在植物中普遍存在。前人的研究發現多倍體與它們的同源二倍體祖先相比具有更高的抗病能力。劉文革等[4]對不同染色體倍性的西瓜枯萎病抗病性進行了研究，結果顯示同源四倍體及同源三倍體對枯萎病的抗病能力均優于其同源二倍體，可連種多茬；四倍體甘藍型油菜、香蕉等表現出更高的潰瘍病、葉斑病抗性[6-8]。本試驗也證明了以上觀點，四倍體比二倍體西瓜抗枯萎病，且發病時間明顯延遲。二倍體西瓜幼苗接種后4 d發病，10 d時大部分死亡，四倍體7 d發病，13 d時大部分死亡，四倍體比二倍體延遲3 d感病。張弛[5]在獼猴桃上的研究發現，二倍體植株在接種潰瘍病菌后3 d內感病，四倍體植株在接種病菌后5 d感病，與本文的觀點一致，均表明四倍體的抗病性強于同源二倍體。

3.2 枯萎病菌在不同倍性西瓜中的侵染過程差異

四倍體西瓜幼苗枯萎病發病癥狀明顯較輕，在表型鑒定的基礎上，筆者通過觀察病菌在植物體內的侵染動態，從生理結構方面深入探究四倍體的抗逆優勢機理。Herman等[13]利用GFP標記技術觀察了枯萎病菌在甜瓜中的侵染過程，發現病菌沿根毛、表皮和皮層侵入木質部。本試驗發現枯萎病菌主要是從西瓜斷根傷口、主根側根間的自然縫隙、根毛等部位侵染西瓜根系，與甜瓜上的觀察結果相似，說明枯萎病菌在不同瓜類作物上入侵方式及過程存在一定的相似性。

病菌侵染植物后寄主會產生一系列抗病反應來抵抗病原菌的侵染和定殖，尤其是抗病品種，程玉瑾等[11]研究發現，西瓜接種枯萎病菌后感病品種根系細胞間菌絲多、侵染速度快，而抗病品種菌絲少、侵染速度較慢。在番茄與白粉病菌的互作研究中發現，抗病品種中分生孢子的萌發率更低。抗病西瓜根系會分泌更多的抗菌物質從而抑制枯萎病菌的生長，相反感病品種則含有更多的酚酸以促進病菌的生長[23]。本試驗觀察對比發現，不同倍性西瓜根系分生孢子的萌發率無明顯差別，但是隨著病菌的侵染，枯萎病菌在四倍體中的侵染速度明顯較慢，細胞間菌絲較少，接種后1 d在二倍體根系就已經零星地觀察到了病菌在維管束中的定殖，而四倍體僅侵染了1—3層表皮細胞，且維管束中尚未觀察到枯萎病菌的定殖現象，推測四倍體可能分泌了更多的抗菌物質以抑制病原菌在植物體內的生長，進而延緩了病害的進一步擴展。

Beckman[24]研究發現，與感病的番茄品種相比抗病番茄莖基部侵填體的形成速度明顯較快，在感病品種中幾乎所有的維管束都逐漸被病菌侵染，而在抗病品種中侵染受到限制。黃萎病菌與抗病番茄的互作研究顯示，病原菌僅停留在根系中，不能向莖葉等地上部分擴展[25]。對黃萎病菌在抗病萵苣中的侵染過程觀察發現，病菌被限制在側根中，從而阻止其向主根中大量的擴散[26]。本試驗也觀察到了類似現象，二倍體根系維管束被菌絲大量侵染時，四倍體西瓜根系維管束中的菌絲明顯比二倍體少，病菌在四倍體西瓜幼苗中的定殖率相對于其同源二倍體較低，枯萎病菌在西瓜幼苗根部定殖率差異顯著，在葉柄部差異極顯著，說明在四倍體西瓜中，枯萎病菌向植株莖部及葉部的擴展得到了一定的限制。枯萎病菌在四倍體西瓜中的侵染過程明顯滯后，與枯萎病的發病癥狀相吻合，進一步說明了四倍體相對于二倍體具有更強的抗枯萎病菌侵染能力。

3.3 不同倍性西瓜幼苗接種枯萎病菌后POD、PAL活性及總酚、類黃酮、丙二醛含量差異

植物根系在感染枯萎病菌后往往會發生一系列的生理生化變化，主要表現為保護酶活性的增強和呼吸作用的上升，并產生一些對病菌有抑制作用的物質，如酚類化合物、類黃酮等來抵抗病原菌的侵染。

許勇等[27]研究表明，隨著枯萎病菌對西瓜的侵染，羥脯氨酸糖蛋白與木質素的含量以及該物質形成過程中相關酶如POD、PAL活性在抗感病品種體內均有提高，但是抗病品種的增幅顯著高于感病品種；鄒芳斌等[28]對6個不同抗性等級的黃瓜品種對比發現，感染枯萎病后葉片組織內POD活性與抗性呈顯著正相關；徐敬華等[29]研究表明，枯萎病菌處理后的西瓜苗PAL活性增加并呈周期性變化，不同部位的區別較大，葉片中表達量最高，PAL活性與抗病性呈正相關。本研究發現，接種枯萎病菌后四倍體西瓜PAL活性逐漸增加，在7 d時達到最高，說明接種枯萎病菌后四倍體幼苗根系產生了大量的PAL來抵御病菌的侵染，在接種7 d后有所下降，可能與選用品種相對感病有關；二倍體PAL活性總體呈下降的趨勢，病菌侵染后四倍體PAL活性的增加量明顯高于其同源二倍體。接種病菌后二倍體及四倍體西瓜根系POD活性均呈增加的趨勢，但四倍體幼苗根系POD活性增加的幅度比二倍體大。總之，病菌侵染后四倍體根系生成了更多的PAL和POD酶以增強植物抗病能力，保護細胞免受傷害。

MDA常被判定植物細胞膜的損傷程度，并作為判定植物抗逆能力的間接指標[30]。趙秀娟等[31]研究發現，苦瓜對枯萎病的抗性與MDA含量呈負相關，感病品種MDA含量均高于抗病品種。本研究對接種枯萎病菌前后不同倍性西瓜根系的MDA含量進行了測定，結果顯示接種后二倍體西瓜幼苗根系MDA含量明顯高于同時期的四倍體，說明在相同的病菌處理下，四倍體西瓜根系細胞膜損傷程度更小，具有更強的抗枯萎病能力。

大量研究顯示，酚類物質含量與植株的抗病性密切相關。對甘薯塊根抗黑斑病研究發現，與感病品種相比，高抗品種總酚的含量增加更多，持續時間更長[32]。在香蕉與枯萎病菌的互作中發現，抗病品種根系酚類物質的增加量比感病品種大[33]。唐永萍等[34]研究表明，抗病的蘋果品種通過調控果實內酚類物質等次生代謝物質含量來增強植物的抗病能力，其中類黃酮和木質素含量的提高增強了植物的抗病反應，提高了對灰霉病的抗性。受黑斑病菌侵染后高抗品種葉片內類黃酮、酚類等抑菌物質的含量高于感病品種，從而提高了甘薯的抗病能力[35]。本試驗也得到了類似的結果，接種枯萎病菌后四倍體西瓜根系中總酚、類黃酮含量的增加量明顯高于同源二倍體，總酚、類黃酮等次生代謝物質含量的優勢使得四倍體植株更能抵御枯萎病菌的入侵。

3.4 不同倍性西瓜抗枯萎病基因PR3、MPK7、PAL、MYB的表達差異

寄主對枯萎病菌的侵染過程反應是多方面的，當病原菌侵染后會自動開啟和增加體內抗病相關（PR）基因、轉錄因子、信號調控基因等的表達，并生成與抗病相關的產物，影響初級代謝的改變，進而表現出不同程度的植物免疫性和抗病性反應。

病程相關蛋白的誘導表達，特別是幾丁質酶（，）的上調表達在西瓜與枯萎病菌抗病互作中可能起到一定作用[36]。一直被認為是一種重要的植物防衛基因。西瓜與枯萎病菌非親和互作中，接種處理后8 d上調表達超過20倍[14]。本研究發現，接種枯萎病菌后，二倍體根系表達量變化不明顯；四倍體表達量不斷增加，在接種后10 d表達量達到最大值，是二倍體同時期表達量的10倍。推測在四倍體西瓜抗病中起到了一定的作用，但作用方式還有待進一步研究。

MAPK是一種蛋白激酶，其廣泛存在于真菌、植物及動物等真核生物中，逆境下條件下MAPK級聯反應在抗病抗逆信號傳遞中發揮著十分重要作用[37-38]。Song等[39]對西瓜MAPK家族基因的功能分析研究發現西瓜枯萎病菌侵染后上調表達，接種后9 d時的表達量是對照的13倍，可能同時參與了多條信號轉導途徑，在干旱、高溫、病菌侵染等多個逆境脅迫中都扮演著重要的角色；同時在本氏煙上的研究結果顯示表達后可以誘導活性氧的積累及防衛基因的表達，從而減少灰霉病對植物的傷害。本研究也同樣檢測了在不同倍性西瓜根系的表達量，結果顯示枯萎病菌侵染的前期四倍體西瓜根系表達量稍低，在侵染后期四倍體表達量明顯高于二倍體，說明在接種的后期四倍體根系能表達更多的，傳遞抗病信號，促進抗病基因的表達，從而降低枯萎病菌對西瓜幼苗的傷害。

大蕉植物體內的克隆、鑒定和表達分析結果顯示的表達可能與香蕉枯萎病抗性相關[40]。張曼等[41]的研究結果顯示，與自根西瓜相比，嫁接西瓜等防衛基因的表達水平較高。本研究發現，接種枯萎病菌后，四倍體西瓜表達量呈先增高后降低的趨勢，在同時期表達量均高于二倍體，最大表達量是二倍體表達量的6倍，說明四倍體根系的抗病防御能力較強。表達量與PAL酶活性變化趨勢一致且在時間上有所提前，推測四倍體植物體內的表達導致了PAL酶活性的變化，從而增加了四倍體植物根系類黃酮及總酚等次生代謝物質的含量，以抑制病原菌在植物體內的生長和定殖。

MYB轉錄因子與茉莉酸（JA）之間具有密切的聯系，已經被證明在抗病中起作用。Lee等[42]研究證明與病害引起的細胞死亡密切相關，并參與了水稻中茉莉酸介導的信號傳導途徑；Sugimoto等[37]研究發現，與煙草高度相似，它能被調控上調表達的激發子所誘導；韓金桓等[43]研究發現，枯萎病菌誘導后在高抗品種根部的表達量峰值出現得早，且表達量高，與感病品種差異顯著。在本試驗中，接種枯萎病菌后二倍體西瓜根系表達量一直處于較低的水平，四倍體根系表達量明顯高于同源二倍體，接種后7、10 d四倍體根系的表達量分別是二倍體同時期表達量的80、35倍。而四倍體西瓜幼苗在7 d時已經開始發病，由于此時表達顯著上調，筆者推測在四倍體幼苗初期的抗病反應中起重要作用。它可能通過調節四倍體類黃酮的合成，參與抗病信號的傳導等方式來參與四倍體的抗病反應，具體的調節方式還有待后續研究驗證。

4 結論

接種枯萎病菌后，與二倍體相比，枯萎病菌在同源四倍體幼苗中的定殖率較低，侵染過程明顯滯后，四倍體西瓜發病癥狀延遲；POD、PAL、總酚及類黃酮的活性/含量整體較高，根系細胞膜受損傷程度小；、、、等抗病基因上調表達。研究結果從不同層面表明四倍體西瓜在抗枯萎病方面存在著一定的優勢，為西瓜多倍體育種和抗病育種提供了理論依據。

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（責任編輯 岳梅）

The Mechanism of Resistance tof. sp.Race 1 in Tetraploid Watermelon

JI WanLi1, ZHU HongJu1, LU XuQiang1, ZhAO ShengJie1, he Nan1, Geng LiHua2, liu WenGe1

(1National Cucurbits and Fruits Improvement Center, Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009;2National Engineering Research Center for Vegetables, Beijing 100097)

【Objective】The Fusarium wilt disease caused by the continuous cropping obstacles is one of the main factors which limits the production of watermelon in recent years. Field observation shows that tetraploid watermelon is more resistant to Fusarium wilt disease than autodiploid watermelon. The objective of this study is to reveal the mechanism of resistance to Fusarium wilt in tetraploid watermelon by comparing the resistant differences of diploid and tetraploid watermelon, and to provide a theoretical basis for polyploidy breeding and disease resistance breeding of watermelon.【Method】The diploid and autotetraploid watermelon seedlings of Zhengzhou No. 3 were used as materials in this research, the differences of the resistance to Fusarium wilt of different ploidy watermelon seedlings were compared after inoculating withf. sprace 1 (Fon 1) at one leaf stage, the Fon 1 with green fluorescent protein (GFP) was used to observe the infection process in different ploidy watermelon seedlings, then the activity/content of metabolites related to disease resistance such as peroxidase (pod), phenylalanine ammonialyase (PAL), malondialdehyde (MDA), total phenols, flavonoid and the expression levels of,,andat different stages of diploid and tetraploid watermelon roots were determined.【Result】After inoculation with Fon 1, for the diploid watermelon seedlings, the Fusarium wilt was observed at the 4th day, and most of the plants died at the 10th day, while the disease was observed at the 7th day, and most of them died at the 13th day in the tetraploid watermelon seedlings. The wilt symptom delayed 3 days in tetraploid watermelon seedlings, tetraploid watermelon seedlings were more tolerant to Fusarium wilt than diploid ones. The infection pathway of Fon 1 was the same in both diploid and tetraploid watermelons. In addition, there was no significant difference in the germination rate of conidia between diploid and tetraploid watermelon roots. However, with the infection of pathogens, the infection speed of Fon 1 in tetraploid seedlings was obviously slower and the intercellular hyphae were less than those in diploid ones. The colonization rate of Fon 1 in the xylem of tetraploid watermelon seedlings was lower than that in diploid plants, which showed significant differences in the roots and extremely significant differences in the petioles of the seedlings, the expansion of the pathogen in the stems and leaves of tetraploid plants was limited to a certain extent. The infection process of Fon 1 in tetraploid watermelon apparently lagged, which coincided withthe disease symptoms. After inoculation with Fon 1, the activity of POD and PAL in tetraploid watermelon seedlings increased, the POD activity of tetraploid watermelon seedlings increased more than that of diploid watermelon seedlings. Tetraploid roots produced more POD and PAL to enhance the plant disease resistance and protect cells from damage. The increasing of total phenols and flavonoid contents in tetraploid watermelon roots were higher than those in diploid ones. The advantages of these secondary metabolites made tetraploid plants more resistant to the invasion of Fon 1. In addition, the content of MDA in the root of tetraploid watermelon was obviously lower than that in diploid at the same time, which indicated that the damage degree of root cell membrane of tetraploid watermelon seedlings was lower after inoculation with Fon 1. Analysis of the expression of resistant genes showed that the expression level oftetraploid watermelon roots increased continuously after inoculation with Fon 1, and reached the highest level at the 10th day, which was 10 times of that of diploid at the same time. At the late stage of inoculation, tetraploid roots exhibited higher expression ofto transmit resistance signals, and the expression of disease resistance genes could be promoted, the damage of Fon 1 on watermelon seedlings would be reduced. The expression level ofincreased firstly and then decreased, and the expression level was higher than that of diploid at the same period, the maximum expression level was 6 times of that of autodiploid. The expressions ofin tetraploid watermelon roots was continuously higher than that of autodiploid, and the expression level was 80 and 35 times of that of diploid on the 7th and 10th day after inoculation with Fon 1.【Conclusion】Through inoculation and identification of Fon 1 at seedling stage, observation of pathogen infection process, changes of metabolic substance content and gene expression level research, the results show that tetraploid watermelon seedlings are more resistant to Fusarium wilt than autodiploid watermelon seedlings.

watermelon; tetraploid;f. sp.race 1 (Fon 1); resistance mechanism

2018-04-28；

2018-06-12

國家自然科學基金（31672178）、國家重點研發計劃（2018YFD0100704）、中國農業科學院科技創新工程專項經費（CAAS-ASTIP-2018- ZFRI）、國家西甜瓜產業技術體系（CARS-26-03）

姬萬麗，E-mail：jiwanliy@163.com。朱紅菊，E-mail：huanpei633@163.com。姬萬麗和朱紅菊為同等貢獻作者。 通信作者劉文革，E-mail：lwgwm@163.com