7個來源地區山荊子的遺傳多樣性與群體結構分析

高源，王昆，王大江，趙繼榮，張彩霞，叢佩華，劉立軍，李連文，樸繼成

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7個來源地區山荊子的遺傳多樣性與群體結構分析

高源，王昆，王大江，趙繼榮，張彩霞，叢佩華，劉立軍，李連文，樸繼成

（中國農業科學院果樹研究所/農業部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城 125100）

【目的】利用熒光SSR分子標記，對新收集的7個來源地區的山荊子種質資源進行遺傳多樣性和群體結構分析，明確群體內和群體間的遺傳多樣性和結構，為蘋果屬植物種質資源的收集保存和種的遺傳進化研究提供依據。【方法】篩選19對多態性好的SSR引物檢測7個來源地區山荊子的多態性，利用GenAlEx 6.501計算遺傳多樣性指標、分析群體間的分子變異（AMOVA），利用GenepopV4和Fstat293分析群體間的遺傳分化，基于Nei遺傳距離，利用POPULATION 1.2構建269份材料的Neighbour-Joining（NJ）進化樹，使用STRUCTURE 2.3.4進行貝葉斯聚類并分析群體的遺傳結構。【結果】19對SSR引物共檢測出392個多態性等位基因，平均等位基因數20.6，平均有效等位基因數9.070，觀察雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.628和0.855，香農多樣性指數為2.392。按照來源地區劃分群體，以黑龍江群體的觀測等位基因數最多為15.684，俄羅斯群體的遺傳多樣性最低，河北群體的遺傳多樣性最高。兩兩群體間遺傳分化系數為0.019—0.111，河北與多個地域的群體基因交流頻繁，甘肅群體是7個群體中最為穩定的，群體間的遺傳分化和基因交流與地理位置遠近不完全相關。基于Nei遺傳距離的聚類分析在遺傳距離0.7444處將269份材料可以分成7個類群，多數類群與地理位置不相關。其中類群Ⅰ和Ⅱ與其他類群遺傳距離較遠，類群Ⅱ和Ⅲ的聚類比較混雜，類群Ⅵ的材料來源最為復雜，類群Ⅳ和Ⅴ相對比較單純，類群Ⅶ中99%為黑龍江山荊子。群體結構分析將269份材料劃分成了3個類群，具有3個可能的基因來源，不同來源地的材料在各群體中均有分布，與地理位置沒有十分明確的相關性。只有黑龍江、山西和甘肅群體以及部分俄羅斯和河北材料的類群歸屬相對單一，與聚類有相似的結果。269份材料中Q≥0.6有232份，大部分山荊子的血緣相對單一。【結論】19對SSR引物具有高度的多態性，可以作為有效的標記用于山荊子群體遺傳多樣性和遺傳結構評價。7個來源地區山荊子遺傳多樣性均較高，以河北地區的遺傳多樣性最高，遺傳變異和分化主要發生在群體內和個體內部；群體間有基因交流，以河北與其他地區的交流最頻繁；抵制基因漂變而導致的群體間的遺傳分化，群體間的遺傳分化程度和基因交流水平與地理位置遠近不完全相關。

山荊子；熒光SSR；遺傳多樣性；遺傳結構

0 引言

【研究意義】山荊子（( L.) Borkh.）屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Mill.）[1]，是蘋果屬植物中分布最廣，變異更為多樣的類群[2]。山荊子花果美麗、樹形優雅，常被用作砧木和園林綠化樹種，果實、種子、幼葉及木材均有很高的經濟利用價值，是蘋果屬植物中較為珍貴的野生資源。具有豐富變異的蘋果屬野生種是蘋果砧木選育和產業可持續發展的重要基礎和必要前提。通過蘋果屬植物的考察和收集，增加蘋果屬優異種的特異類型，并開展新收集蘋果屬植物種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構的評價，對明確收集保存蘋果屬植物的遺傳多樣性水平，指導其保護和有效利用具有重要意義，為研究種的遺傳進化提供依據。【前人研究進展】山荊子主要分布于中國的東北、華北及西南，包括遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、河北、山西、山東、陜西、甘肅、四川、云南、貴州及西藏；朝鮮及西伯利亞亦有分布[3-6]。山荊子原產于亞洲東北部，在長期演變和進化過程中形成了豐富的變異類型[2]。通過其表型和不同居群遺傳多樣性研究表明，其居群間的遺傳分化和親緣關系較為復雜[7-10]。探明不同來源區域山荊子種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構是闡明其種群親緣關系和系統進化的重要途徑。山荊子的形態變異式樣已經得到了充分的研究[11-12]，利用RAPD[9]、ISSR[13]和SSR[14]分子標記僅對少數居群的遺傳多樣性進行研究。其中，王雷宏等[14]僅利用10對SSR引物對河北塞罕壩、山西靈空山、山西管涔山、山西中條山、山西五臺山、黑龍江小興安嶺以及北京東靈山8個山荊子居群140個單株的遺傳多樣性和遺傳關系進行分析，推測山荊子起源于中國華北和東北地區，山西靈空山、黑龍江小興安嶺、吉林長白山以及山西中條山居群可能為遺傳多樣性的核心居群。平均每個居群不到20個個體，且有4個居群來自于山西，因此，有必要通過利用多態性更高、數量更多的SSR引物以及更先進的檢測和數據方法對更廣泛來源的山荊子群體進行遺傳多樣性和群體結構分析。【本研究切入點】以往對于山荊子的遺傳多樣性研究主要注重于其表型，利用分子標記的方法僅對少數居群進行過研究，擴增產物的檢測均采用的凝膠電泳。熒光SSR分子標記是將SSR分子標記和熒光標記技術相結合，利用測序儀進行產物檢測，具有效率高、準確度和靈敏度好、避免人工判讀條帶的誤差等優點。中國農業科學院果樹研究所國家果樹種質興城梨、蘋果圃自2008年至2015年分別對黑龍江、吉林、內蒙古、山西、甘肅和河北等中國野生蘋果資源的主要分布區以及俄羅斯的西伯利亞地區進行蘋果種質資源的考察和收集，并實現入圃安全保存。基于已經廣泛收集的山荊子種質資源，利用熒光SSR分子標記的方法，以研究蘋果屬山荊子種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構。【擬解決的關鍵問題】本研究篩選19對高效的SSR引物，對新收集的7個來源地區的269份山荊子種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構進行分析，明確已收集區域該種的遺傳多樣性水平和遺傳變異，以期為該種的進一步有效收集和保護、起源和地理演化規律研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試每份種質均為2008年至2015年蘋果資源的原生境考察過程中，在野外通過表型鑒定為山荊子本種之后，采集其野生群落的特異類型種質接穗，引入國家果樹種質興城梨、蘋果圃內無性繁殖，待鑒定評價后給予國圃號。于2016年春季采集嫩葉并進行試驗，2017年完成所有材料的SSR分子標記鑒定，所有供試山荊子材料信息見電子附表1。其中MB26—MB37和MB130—MB148保存于國家果樹種質公主嶺寒地果樹圃（吉林省公主嶺），其余供試山荊子材料保存于國家果樹種質興城梨、蘋果圃（遼寧省興城）。269份山荊子材料包括來源于俄羅斯37份、黑龍江92份、吉林19份、內蒙古44份、河北58份、山西15份和甘肅4份。

1.2 試驗方法

采用德國QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取供試材料春季嫩葉的基因組DNA。從Hokanson等[15]、Liebhard等[16]、Yamamoto等[17]和Guilford等[18]報道的序列中選取擴增產物片段長度在100—300 bp并經檢測具有高度多態性的SSR引物19對，除GD15和NH015a在蘋果染色體上的位置未知外，其余17對SSR引物均來源于編碼區并分別定位于10條染色體上[17,19-20]，19對引物所屬染色體連鎖群、引物名稱編號和序列見電子附表2。其中，NH009b、NH015a和NZ28f4SSR為梨SSR引物，NH015a定位于梨的第17染色體上。SSR反向引物和5’端帶有6FAMTM熒光標記SSR正向引物由上海生工有限公司合成。

PCR體系參照Cao等[21]，擴增產物的純化體系參照高源等[22]方法。PCR反應在Bio-Rad PTC-200上進行。PCR擴增并經過純化后的SSR熒光標記產物在美國ABI 3730基因測序儀上進行熒光檢測，收集原始數據。

1.3 數據統計與分析

利用GeneMapper3.0軟件對ABI3730收集數據進行分析，獲得不同樣品在每個SSR位點的擴增片段長度。利用遺傳數據分析軟件GenAlEx 6.501[23-24]計算多態性等位基因數（）、SSR 位點的有效等位基因數（）、觀察雜合度（）、期望雜合度（）、固定指數（）及香農多樣性指數（）等遺傳多樣性指標，并分析群體間的分子變異（AMOVA）。利用GenepopV4和Fstat293[25-26]計算群體間的遺傳分化系數和群體遺傳多樣性、群體內遺傳多樣性、群體間的遺傳多樣性、遺傳分化系數和基因流。基于Nei遺傳距離[27]，利用POPULATION 1.2構建269份山荊子材料的Neighbour-Joining（NJ）進化樹，并用在線繪圖軟件iTOL（Interactive tree of life）[28]繪制。使用STRUCTURE 2.3.4進行貝葉斯聚類[29]，分析群體的遺傳結構并確定最佳的群體分組。首先設定等位變異頻率特征數（遺傳群體數）K=1—5，設定Burn-in周期為100 000，MCMC的重復次數為100 000次，采用混合模型和相關等位基因頻率，對不同的K值進行10次重復運行，然后將后綴為“_f”的結果文件壓縮，上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網站（http://taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），據Evanno等[30]的方法計算得到Delta K和似然值的對數函數Lnp（D），分別針對基因庫數目（K）建模，確定最佳K值。利用CLUMPP 1.1.2軟件[31]處理10次獨立運行得到的分配系數Q值（即每一個類群內每個個體之間的估測系數），然后使用DISTRUCT 1.1軟件[32]將計算結果進行圖形化輸出。

2 結果

2.1 SSR擴增產物的多態性

19對具有明顯多態性的SSR引物對269份山荊子材料的基因組DNA進行擴增，共擴增出392個多態性等位基因（），多態性等位基因數為13（NZ28f4）—32（CH01d08），平均等位基因數為20.6（表1）。每份樣品在每個位點產生2個相同（單峰）或不同（雙峰）的等位基因。有效等位基因數（）為2.343（NZ28f4）—16.334（CH01d08），平均值為9.070。觀察雜合度（）為0.476—0.859，平均值為0.628。期望雜合度（）為0.573—0.939，平均期望雜合度為0.855。香農多樣性指數（）為1.307—3.044，平均值為2.392。而固定指數（）只有在NZ28f4中為負值，其余均為正值，說明供試山荊子群體內含有的雜合子較少。

表1 不同SSR位點的遺傳多樣性特征

2.2 7個山荊子群體的遺傳多樣性

將所有山荊子材料按照來源地區劃分為7個群體（表2），黑龍江群體的觀測等位基因數最多為15.684；河北群體的有效等位基因數和香農指數最高，分別為8.218和2.278；全部群體的雜合度均高于0.5，俄羅斯群體的觀察雜合度最高為0.725；河北群體的期望雜合度最高為0.852；期望雜合度與觀察雜合度差值最小的為俄羅斯群體，差值最大的為河北群體；固定指數在各個群體均為正值，其中在俄羅斯群體中最小為0.126，相比于其他群體其雜合子較多。

2.3 群體間的遺傳分化和分子變異

為了揭示各個收集區域山荊子群體的遺傳差異，按照來源地劃分群體后計算Nei遺傳距離（表3）。可以看出，甘肅與吉林群體間遺傳距離最大為1.061，除山西群體外，甘肅與俄羅斯、黑龍江、內蒙古和河北群體的遺傳距離均較大；吉林與內蒙古群體間的遺傳距離最小為0.193，除甘肅外，吉林與其他5個來源地山荊子的遺傳距離均相對較小。甘肅與其他來源地群體的遺傳距離總和最大，其次是俄羅斯群體，最小的為河北群體。從一定程度上體現了群體間地理距離與遺傳距離的相關性。

表2 7個來源地區山荊子群體的遺傳多樣性

表3 7個來源地區山荊子群體間遺傳距離和遺傳分化系數

對角線下方的值為群體間遺傳分化系數（），對角線上方的值為群體間Nei遺傳距離

The data below the diagonal is, and above the diagonal is Nei genetic distance

群體發生分化主要是基因型或基因型頻率不同，因此，基于SSR基因型鑒定，推測山荊子的基因分化。如表4所示，所有供試山荊子在種水平的基因多樣性為0.868，群體內遺傳多樣性為0.831，群體間遺傳多樣性為0.037，居群間基因分化系數為0.049，基因流為5.785。對7個群體進行群體分子遺傳變異方差分析，遺傳結構分類群的遺傳變異極顯著（＜0.001），群體內方差分量的貢獻率占23%，而群體間方差分量的貢獻率僅占4%，個體內方差分量的貢獻率占73%。山荊子基因分化和分子遺傳變異2個系數指標分析結果一致，說明山荊子整體遺傳多樣性較高，但其主要分布在群體內部和由個體差異產生的遺傳變異，群體間分布較低的遺傳多樣性。

7個山荊子群體基因流平均值為5.785，根據公式=0.25（1-）/，計算群體間遺傳分化系數為0.0414，即7個群體間的遺傳變異為4.14%，與群體分子遺傳變異方差分析（AMOVA）中群體間方差分量的貢獻率相一致；而群體內的遺傳變異為95.84%，表明各個群體在過去的某個時間相互都可能曾發生過基因交流，但同時這又抵制了由于基因漂變而導致的群體遺傳分化。7個群體兩兩間遺傳分化系數為0.019—0.111，河北與吉林群體間的遺傳分化系數最低為0.019，而甘肅與內蒙古群體間的遺傳分化系數最高為0.111。俄羅斯群體作為國外的群體，也是供試地理位置最北端的群體，其與甘肅群體的遺傳分化系數最高為0.073，其次是與內蒙古群體，而與河北群體的遺傳分化系數最低。群體間遺傳分化系數與其地理位置遠近不完全相關。

表4 基于SSR標記的7個來源地區山荊子群體的分子方差分析（AMOVA）和基因分化

2.4 基于Nei遺傳距離的聚類分析

基于所有山荊子材料的SSR數據的Nei遺傳距離進行NJ聚類。在遺傳距離0.7444處，269份材料可以分成7個類群（圖1）。其中類群Ⅰ和Ⅱ與其他類群遺傳距離較遠，類群Ⅰ遺傳多樣性豐富，包含來自黑龍江、吉林、內蒙古和河北的19份材料；類群Ⅱ主要為內蒙古的12份和河北的19份材料，以及9份吉林和3份黑龍江材料。類群Ⅲ包含4份俄羅斯、10份內蒙古、6份山西、1份吉林和1份河北材料；類群Ⅳ主要為河北的22份和俄羅斯的27份材料，以及1份黑龍江、2份山西和4份吉林材料；類群Ⅴ主要包含內蒙古的14份、黑龍江的2份和河北的2份材料；類群Ⅵ的40份材料來自供試的全部7個來源地，材料來源最為復雜，相互交錯在一起；類群Ⅶ中除1份河北材料，其余全部為來自于黑龍江。

黑色分支線為類群Ⅰ，紫紅色分支線為類群Ⅱ，橘色分支線為類群體Ⅲ，藍色分支線為類群Ⅳ，紫色分支線為類群Ⅴ，綠色分支線為類群Ⅵ，紅色分支線為類群Ⅶ

2.5 群體遺傳結構分析

基于SSR分子標記數據對269份山荊子材料進行群體結構分析，設置分析群體數K為1—10，重復10次。根據得到的結果（圖2-A），隨著K值的增加，Lnp（D）一直上升，無明顯的拐點。因此，根據Evanno等[30]的方法，用△K來確定K值，當K=3時，△K取得最大值（圖2-B）。所以，可以將269份材料劃分為3個群體，具有3個可能的基因來源，不同來源地的材料在群體中均有分布（圖3）。黑龍江、甘肅和山西的材料與其他區域分化明顯，內蒙古材料在區域內部有明顯分化；河北和俄羅斯的材料群體區域內分化亦明顯，基因來源相似。群體結構分析結果與SSR聚類結果一致。

根據計算出來的各個群體中的Q值分布，當某一材料在某群體中的Q≥0.6時，認為該材料血緣比較單一，Q＜0.6則認為該材料擁有混合來源[33]。本研究有232份材料Q≥0.6，說明大部分山荊子的血緣相對單一；擁有混合來源的材料僅占13.75%。在Q≥0.6的232份材料中，包含的俄羅斯材料屬于類群2（紅色）和類群3（藍色）的數量分別為25份和6份，黑龍江材料屬于類群1（綠色）和類群3的數量分別為73份和6份，吉林材料分屬于3個類群的數量分別為9份、5份和3份，內蒙古材料屬于類群1和類群3的數量分別為25份和15份，河北材料分屬于3個類群的數量分別為6份、10份和30份，山西材料除1份屬于類群1外，其余12份屬于類群3，甘肅材料全部屬于類群3。

3 討論

3.1 山荊子的遺傳多樣性

本研究利用19對SSR引物，對7個來源地區的269份野生山荊子種質資源進行遺傳多樣性分析，19個SSR位點除2個位點在染色體上的位置未知外，其余17對SSR引物定位于10條染色體上，全部為多態位點，在群體中多態位點的百分率為100%。表明這19個微衛星位點均具有高度的多態性，雖未全部覆蓋所有的染色體，但在種群間可轉移性高，可作為有效的遺傳標記用于山荊子遺傳多樣性和遺傳結構分析。

Delta K 和似然值的對數函數LnP(D)根據Evanno等[30]的方法計算得到，分別針對基因庫數目（K）建模

RU：俄羅斯；HLJ：中國黑龍江；JL：中國吉林；NMG：中國內蒙古；HB：中國河北；SX：中國山西；GS：中國甘肅。縱坐標為Q值（每一個類群內每個個體之間的估測系數）0.00—1.00，橫坐標為7個來源地區群體代碼，7個群體間用黑線分隔

觀測等位基因數（）是衡量SSR位點多態性和群體變異程度高低的重要指標。19對SSR引物在7個群體269份材料中共擴增出392個等位基因，平均每個位點擴增20.6個（=20.6），遠高于前人利用SSR標記對三葉海棠[34]、刺梨[35]、豆梨[36]和櫻桃[37]等野生果樹種質資源進行研究的結果。

平均有效等位基因數（）、平均Shannon 信息指數（）、平均期望雜合度（）等是評價遺傳多樣性的重要指標。本研究表明7個來源地的269份山荊子的遺傳多樣性（=0.855，=2.392，=9.070）高于以往研究的三葉海棠[34]（）（=0.699，=1.458，=3.954）、湖北海棠[38]（）（=0.2628，=0.4015，=1.4375）、變葉海棠[39]（）（=0.4389，=0.6282，=1.81）和新疆野蘋果[40]（）（= 0.2619，= 0.4082，=1.4252），也高于前人研究山荊子遺傳多樣性（）（=0.3386，=0.4961，=1.6021）[9]、（=0.5285，=1.6169）[14]，與蘋果屬野生種[41]（=0.86，=2.07）的遺傳多樣性相接近。相較于蘋果屬其他植物而言，供試7個山荊子群體的遺傳多樣性處于較高水平，充分證明了其是蘋果屬變異更為多樣的類群[2]。推測原因，其一是本研究中的山荊子材料來源廣泛，地域跨度大，從華北、西北到東北，而且包含了國外種質資源考察收集的種質；其二是收集材料中大多來自于山荊子原生境野生分布群落，有的成片分布、有的零散分布，未經過較多的人為干預；其三可能是由于蘋果屬植物種間幾乎不存在生殖隔離，極易發生屬內種間自然雜交，導致種間基因互滲。但究其遺傳多樣性高的深入原因，是否真的與種間基因互滲有關，還需要通過根據山荊子來源區域探究與其地理位置相近的蘋果屬各種間的親緣關系和遺傳結構進一步證明。

在以往的對野生蘋果種質資源的考察收集過程中，在幾乎所有的考察區域均可收集山荊子本種的不同類型，這也充分證明了其是蘋果屬中分布最廣的種[2]。對蘋果屬植物種質資源的考察和收集要盡可能多的涉及到其原生境分布區域，在生產和人為干預之前搶救性收集蘋果野生資源并實現其安全保存，仍然是較快提高國家蘋果種質資源圃蘋果屬植物種質資源的遺傳多樣性水平的重要方式。

3.2 7個群體的遺傳多樣性

對按照來源地劃分的7個群體進行比較分析，發現7個山荊子群體的遺傳多樣性水平均處于較高的水平。一般認為雜合度高于0.5的種群沒有經過高強度的人工選擇，具有較高的遺傳多樣性[42]，本研究中7個群體雜合度均高于0.5，均未經過高強度的人工選擇，遺傳多樣性相對較高。相比而言，黑龍江群體的觀測等位基因數最多，而河北群體的有效等位基因數和香農指數最高，這表明河北群體可能比黑龍江群體存在更豐富的稀有基因，遺傳多樣性也比黑龍江群體更高。根據雜合度的意義，雜合度觀測值和雜合度期望值的相近程度也可以衡量群體的遺傳多樣性，它們的值越接近，群體遺傳多樣性越高[42]。期望雜合度與觀察雜合度差值最小的為俄羅斯群體，差值最大的為河北群體，因此，根據固定系數雖然俄羅斯群體中比其他群體含有較多的雜合子，但河北群體的遺傳多樣性最高。群體間的遺傳多樣性比較可以指導蘋果屬植物種質資源的收集，本研究中7個區域遺傳多樣性水平均較高，但黑龍江和河北地區可以作為山荊子的優先收集區域考慮。

3.3 群體間的遺傳分化

估算群體間的遺傳分化系數可區分群體間和群體內相對遺傳變異大小，是解釋群體遺傳變異程度的主要依據[43-44]。WRIGHT[45]認為，若群體值為0—0.05，則表明其各亞群間不存在分化；若值為0.05—0.15，為中度分化；若值在0.15—0.25，則為高度分化。本研究兩兩群體間遺傳分化系數為0.019—0.111，其中黑龍江與俄羅斯群體、內蒙古與俄羅斯群體、甘肅與俄羅斯群體、甘肅與黑龍江群體、甘肅與吉林群體、甘肅與內蒙古群體、甘肅與河北群體發生中度分化，其余兩兩群體間均未發生分化，群體間的遺傳分化與地理位置遠近不完全相關。根據基因流與遺傳分化系數的計算公式可知，每代遷入的有效個體數與群體間遺傳差異水平成反比，群體越穩定，度量群體間遺傳差異程度的值越大，反之當值比較低時，則對應的群體基因穩定性越差，基因交流越頻繁[40]。本試驗中河北與吉林群體的值最低，河北與山西群體的值次之，河北與俄羅斯群體的值再次之。充分說明了河北群體與多個地域的群體基因交流頻繁，甘肅群體是7個群體中最為穩定的，群體間的基因交流與地理位置遠近不完全相關，但基因交流的同時又抵制了由于基因漂變而導致的群體間的遺傳分化。山荊子常被用作實生砧木，隨苗木調運長距離運輸，由此造成種質交流頻繁。本次供試山荊子材料雖均來自于野生群落，但有的群落為成片分布，有的為零星分散分布，尤其是河北地區收集到的山荊子材料，其中有少部分材料來源于生產園周邊的半山坡上，河北地區蘋果栽培歷史悠久，是蘋果主要產區之一，因此，究其歷史不排除收集的野生山荊子基因來源于其他地區的可能。而黑龍江、吉林、內蒙古、甘肅和山西材料均完全來自于山區、林區或自然保護區等純野生環境。這也許可以解釋為何河北群體與多個地域的群體基因交流頻繁。

3.4 群體遺傳結構

群體遺傳結構是群體內各個亞群的分布情況，同時也反映了亞群的結構特征。利用STRUCTURE軟件分析群體結構是基于不同個體中等位基因出現的頻率，通過計算Q值（第份材料SSR位點變異源于第K群體的概率）而歸類。所有供試山荊子材料可以分為3個類群，有3個可能的基因來源，與地理位置沒有十分明確的相關性，只有黑龍江、山西和甘肅群體以及部分的俄羅斯和河北材料類群歸屬相對單一，這與Nei遺傳距離的NJ聚類結果相一致；諸多地理位置相近的種質也未聚到一起，這與王雷宏等[14]的研究結果相一致。按照Wright[45]的理論和王雷宏等[14]對山荊子的研究，山荊子群體相對穩定，不存在遺傳漂變，但分化程度較高。通過本試驗研究，山荊子群體的遺傳變異和分化主要存在于群體內部和個體內部，抵制基因漂變產生群體間遺傳分化。本研究群體遺傳結構分析對指導蘋果屬植物種質資源的進一步考察和收集具有重要的意義，并為后續研究蘋果屬植物的進化提供了依據。

4 結論

19對SSR引物具有高度的多態性，可以作為有效的標記用于山荊子群體遺傳多樣性和遺傳結構評價。7個來源地區山荊子遺傳多樣性均較高，以河北地區的遺傳多樣性最高，遺傳變異和分化主要發生在群體內和個體內部；群體間有基因交流，以河北與其他地區的交流最頻繁；抵制基因漂變而導致的群體間的遺傳分化，群體間的遺傳分化程度和基因交流水平與地理位置遠近不完全相關。

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（責任編輯 李莉）

The Genetic Diversity and Population Structure Analysis on(L.) Borkh from 7 Sources

GAO Yuan, WANG Kun, WANG DaJiang, Zhao JiRong, ZHANG CaiXia, CONG PeiHua, LIU LiJun, LI LianWen, PIAO JiCheng

(Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】Genetic diversity and population structure offrom 7 newly collected sources were analyzed using fluorescent SSR molecular markers. The identification of genetic diversity and structure within and among populations can provide references for germplasm collection and preservation of Malus and the study of the phylogenetic evolution of species. 【Method】19 pairs of polymorphic SSR primers were screened to detect the polymorphism offrom 7 sources. GenAlEx 6.501 was used to calculate the index of genetic diversity and analyze the molecular variation (AMOVA) among populations. The genetic differentiation among populations were analyzed by GenepopV4 and Fstat293. Based on the Nei genetic distance, the Neighbour-Joining (NJ) evolutionary tree of 269 accessions was constructed using POPULATION 1.2. The Bayesian cluster was carried out using STRUCTURE 2.3.4 to analyze the genetic structure of populations.【Result】392 polymorphic alleles were detected by 19 pairs of SSR primers, with an average allele number of 20.6 and effective allele number of 9.070. The average values of heterozygosity and expected heterozygosity were 0.628 and 0.855 respectively, and the Shannon index was 2.392. Dividing populations according to their sources, the highest number of observed alleles in Heilongjiangpopulation was 15.684. The genetic diversity in Russian population was the lowest, and the highest genetic diversity was in Hebei population. The coefficient of genetic differentiationbetween every two populations was from 0.019 to 0.111. The gene of Hebei population communicate frequently with other populations, andGansu population was the most stable among 7 populations. The genetic differentiation and gene exchange among populations were not completely related to the geographical location far or near. The cluster analysis based on Nei genetic distance could divided 269 accessions into 7 groups at 0.7444. Most of groups were not related to geographical location, among which group Ⅰ and Ⅱ were far away from other groups, and the cluster of groupⅡ and Ⅲ was mixed, the sources of group Ⅵ was the most complex, groupⅣ and Ⅴ were relatively pure, and finally 99% of all accessions in group Ⅶ were from Heilongjiang. The population structure analysis divided 269 accessions into 3 groups with 3 possible genetic sources. The accessions from different sources were distributed into every group, and there was no clear correlation with the geographical location. Only most part ofHeilongjiang, Shanxi and Gansu population, as well as some of accessions from Russia and Hebei belonged to a relatively simple group. This result was similar to the results of clustering. In 269 accessions, the Q value of 232 accessions were higher than 0.6, and most of them had relatively single genetic background. 【Conclusion】19 pairs of SSR primers were highly polymorphic and could be used for the evaluation of genetic diversity and population structure. The genetic diversity offrom 7 regions was high with the highest genetic diversity of thosefrom Hebei, and genetic variation mainly occured within populations and individuals. There was genetic communication among populations with the most frequent communication between Hebei and other groups, but at the same time, it also resisted genetic differentiation among populations caused by gene drift. Genetic differentiation and gene exchange among populations were not completely related to geographical location.

; fluorescent SSR; genetic diversity; population structure

2018-04-25；

2018-05-15

中國農業科學院創新工程項目（CAAS-ASTIP-2016-RIP-02）、農業部現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-27）、農作物種質資源保護（NB2015-2130135-39）、國家公益性行業（農業）科研專項（201303093）

高源，E-mail：gaoyuan02@caas.cn。 通信作者叢佩華，E-mail：congph@163.com。通信作者王昆，E-mail：wangkun5488@163.com