石油對中華絨螯蟹抗氧化酶活性的影響

藺翠翠，鄭懷東，劉學光，關 麗，聞福安，郭欣碩

（1.遼寧省水產品質量安全檢驗檢測局，遼寧 沈陽 110000；2.沈陽市動物衛生監督所，遼寧 沈陽 110000）

石油是含有多種物質的復雜混合物，其中包括多種毒性大且具有“三致”效應的有機物質，如苯系化合物、多環芳烴（PHAs）等，因此它對生態環境具有極其嚴重的危害潛能，被許多國家納入危險物質清單。美國國家環境保護局（USEPA）在1979年公布的129種優先控制污染物名單中就己包含了16種PAHs。我國水中優先控制的68種污染物黑名單中PAHs也在其列。石油通過各種途徑進入生態環境后，對環境、植物、生物體乃至人類將產生持久性損害。酶是生物體用來維持機體正常新陳代謝的重要生物大分子，所有的生命活動都離不開酶的正常運行。酶活性被認為是一種能夠快速而靈敏地反映環境脅迫對生物體影響的生化指標。石油進入生物體后，通過誘導可產生大量的ROS攻擊酶致使酶失活，同時還將與機體的抗氧化酶系統直接發生作用，導致酶的表達和活性都發生變化。細胞中存在大型的抗氧化防御系統能夠及時清除ROS，抗氧化酶是清除ROS的第一道防線。

中華絨螯蟹廣泛分布于我國東部沿海、湖泊河流，是一重要的傳統經濟蟹類。是我國出口優勢水產品之一，其肉質鮮美，是廣受喜愛的食用水產品。鰓是河蟹的呼吸器官，同時承擔著調節滲透壓和離子平衡的作用；肝胰腺是河蟹重要的解毒器官，在降低或消除外來有毒物質毒害影響方面起著重要作用。本課題組在前期研究中發現，石油在河蟹體內的積累具有明顯的組織差異性，肝胰腺和腮的積累量較高，是急性毒性的主要靶點，并且能夠造成組織器官的顯微結構變化。許多學者已將抗氧化酶作為生物體氧化脅迫的和損傷的標志物，因此，本文就不同濃度的石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮組織細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）酶活性的影響進行了研究，旨在探明石油對抗氧化酶系統的毒性影響程度與致毒機制，為水產品的安全養殖提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：中華絨螯蟹由盤錦光合蟹業有限公司提供，雌雄隨機，平均體重51.2±0.35克，實驗中飼養水采用鹽度為3‰的人工海水模擬生活環境。暫養5天后選擇大小適中、活力強的中華絨螯蟹作為實驗用蟹。

石油烴母液：1升燒杯中加入0號柴油和實驗用水，體積比約為1∶1，磁力攪拌器攪拌24小時，放置分層，虹吸下層溶液作為實驗用母液。

實驗儀器：電動勻漿機（IKA TIGITAL）、均質器（IKA T10B）、雙光束紫外分光光度計（北京普析通用U V-1800）、低溫冷凍離心機（日本C F16R XⅡ）、數顯恒溫水浴鍋（愛朗2000）、電子天平（Sartorius，BT25S）、低溫冷凍離心機（日本CF16RXⅡ）。

1.2 實驗設計

采用急性毒性實驗方法，由概率單位法計算得出石油對中華絨螯蟹的96小時半致死濃度（LD50）；根據LD50濃度設計3個實驗組，分別為低濃度組：6毫克/升、中濃度組：11毫克/升、高濃度組：22.5毫克/升，同時設對照組，每組設3個平行；隨機選取大小基本一致的15只中華絨螯蟹（雌雄分開）放入塑料養殖箱（42厘米×31厘米×26厘米），加入4升含有不同濃度受試物的養殖水，并用薄膜封口，以保證實驗組濃度恒定。染毒時間為96小時，實驗期間每天投喂成蟹飼料，下午投餌前吸凈殘餌，更換飼養用水，確保試驗組濃度穩定，實驗期間及時清理死亡個體。

1.3 實驗方法

樣品處理：實驗結束后，各組隨機選取3只中華絨螯蟹，迅速解剖，取出肝胰腺和腮，先用預冷生理鹽水清洗、濾紙吸干表面水分，稱重后按重量（克）∶體積（毫升）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，玻璃勻漿器冰浴勻漿，勻漿液4℃勻漿10分鐘，2500轉/分離心10分鐘，上清液-20℃保存，一周內測定酶活性。

酶活測定：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽硫轉移酶（GST）活力測定具體操作步驟按照南京建成提供的試劑盒使用說明進行操作，酶活性單位采用單位/毫克蛋白。總蛋白濃度采用Bradford法進行測定，采用南京建成蛋白定量測試盒。

1.4 數據統計

所有實驗結果用平均值±標準差（Mean±SD）表示，SPSS18.0軟件進行統計分析，檢驗數據正態分布性，單因素方差分析（ANOVA），Duncan法進行多重比較，差異顯著臨界值為0.01。

2 結果

2.1 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活性影響見圖1。石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活的影響總體呈現出先升高再降低的趨勢。肝胰腺對照組SOD酶活為84單位/毫克蛋白，低濃度組酶活為153單位/毫克蛋白，較對照組有顯著的升高（P＜0.01），中高濃度組酶活分別降至116和68單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01）。腮對照組酶活為149單位/毫克蛋白，酶活最高值為低濃度組的220單位/毫克蛋白，顯著高于對照組（P＜0.01），最低值為高濃度組的111單位/毫克蛋白，低于對照組的50%。

圖1 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影響

2.2 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的CAT酶活性影響見圖2。石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活的影響呈現出低—高—低的變化趨勢，肝胰腺對照組CAT酶活為2.8單位/毫克蛋白，低濃度組酶活為2.2單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01），中濃度組酶活升至6.9單位/毫克蛋白，而高濃度處理CAT酶活又降至4.1單位/毫克蛋白。腮對照組CAT酶活為2.2單位/毫克蛋白，與肝胰腺CAT活力變化趨勢類似，腮CAT酶活性最高值出現在中濃度處理組為8.4單位/毫克蛋白，顯著高于對照組（P＜0.01）。最低值則出現在低濃度處理組為1.6單位/毫克蛋白。

圖2 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影響

2.3 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮GST酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹的肝胰腺和腮GST酶活影響見圖3。石油對中華絨螯蟹肝胰腺GST酶活影響先降后升的變化趨勢，肝胰腺低濃度組酶活性為80單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01），中、高濃度組肝胰腺酶活分別為117單位/毫克蛋白和132單位/毫克蛋白，與對照組差異極顯著（P＜0.01）。腮GST變化趨勢為低-高-低，GST酶活性最高值出現在中濃度組為196單位/毫克蛋白，而最低值則為高濃度組的132單位/毫克蛋白，均與對照組差異顯著（P＜0.01）。

圖3 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮GST酶活的影響

3 討論

甲殼動物等無脊椎動物體內缺乏特異性免疫機制，而主要依靠血細胞吞噬，作用抵御外界污染脅迫，血細胞在吞噬外援異物過程中會釋放活性氧。在正常條件下，生物體內氧自由基的產生和清除處于一種動態平衡中，生理濃度的氧自由基不但不會危害生物體，反而能起到一些獨特的生理作用。對甲殼動物來說，它可以參與細胞的分裂生長、吞噬細胞的吞噬作用和受精膜的形成。但石油的存在將打破這種平衡，使甲殼動物產生大量氧自由基，造成對機體內生物大分子如脂類、蛋白質的氧化破壞，引起細胞損傷，從而使其喪失功能。甲殼動物清除體內氧自由基主要通過抗氧化系統，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫轉移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）等多種活性酶完成。因此，抗氧化酶活性也是衡量機體過氧化程度的重要指標，通過監測這些指示性抗氧化酶的活力可以間接反映甲殼動物體內氧自由基含量，顯示出機體受威脅程度。

SOD專一催化超氧陰離子，將之歧化為H2O2和O2，H2O2可被CAT和se-GPx進一步分解為H2O和O2，從而阻止超氧陰離子轉化為活性更高的-OH。在本實驗研究中，低劑量組的SOD酶活表現出激活狀態，這與余群、張景飛等人的研究結果一致，分析這種激活由細胞內氧自由基被石油大量誘導而產生。中高劑量組肝胰腺和腮的SOD活性被抑制，這與石油長期脅迫從而使中華絨螯蟹機體富集過多的氧自由基有關，過多的活性氧對中華絨螯蟹體內的各種生物大分子，如脂類和蛋白質等產生氧化性的破壞作用，從而引起細胞損傷，進而使其喪失生理功能，對機體造成不可逆損傷。

CAT是一種含有Fe的金屬酶，能夠將SOD催化產生的H2O2分解為H2O和O2，當受到較低濃度石油脅迫時，SOD活力的上升會導致體內H2O2和羥自由基(-HO)含量的增加，如不及時清除，則會對機體造成更大的氧化損傷。此時，肝胰腺中CAT合成被激活，酶活性上升，起到了清除過量H2O2以保護機體的作用。本實驗表明，石油對中華絨螯蟹CAT活性的影響在低劑量抑制過后，中劑量表現出對CAT的激活作用，這與SOD、CAT在功能上的相關性有關，在中劑量組石油的長期脅迫下，中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD活力開始受到抑制，此時O-2的大量增加可誘導CAT活力的升高，從而消除機體的過氧化。

GST是一類多功能的解毒酶。特定的GST亞基對致癌性環氧化物和農藥等異生物質有特異的高催化活性，使之與GSH結合成低毒易排泄的化合物，屬機體11相代謝酶。同時GST也具有GPx活性，GST的多功能性使得它在機體的解毒代謝中有十分重要的作用。本實驗結果表明，低濃度組GST活力受到抑制，由于SOD活力的上升加快對氧自由基的清除，遏制了GST的活性。中高濃度組肝胰腺和腮的GST活力都被顯著誘導，表現出較強的敏感性和誘導性，即使腮高濃度組GST活力開始下降，但活力仍超過對照組，說明中華絨螯蟹GST在石油烴的解毒過程中有重要作用。而高濃度組腮GST活力的下降與脂質過氧化和生物大分子損傷的持續增加有關，說明此時GST活性下降是自由基的毒性作用所致。GST活性下降的原因有可能是作為底物的GSH被大量消耗，同時解毒過程中產生的大量中間代謝物有可能改變GST亞基的組成降低GST活性。

4 結論

石油能夠影響中華絨螯蟹的抗氧化系統酶活性，酶活性的變化是中華絨螯蟹對石油危害的一種防御反應。中華絨螯蟹抗氧化酶活性隨石油污染物脅迫的時間和濃度發生規律性變化，對SOD和GST酶活影響的規律是先升高再降低，對CAT酶活的影響規律為低—高—低。本實驗結果表明中華絨螯蟹的抗氧化系統對石油具有較高的敏感性，其抗氧化系統中SOD、CAT、GST等對解除石油造成的機體過氧化毒性方面具有重要作用。