不同產地抱莖苦荬菜的HPLC指紋圖譜研究△

楊非凡，張亞妮，武媛媛，李亞梅，王燕秋，李遇伯*

(1.天津中醫藥大學 中藥學院，天津 300193；2.吉林通化華夏藥業有限責任公司，吉林 通化 134000)

抱莖苦荬菜具有清熱解毒、鎮痛抗炎、涼血消腫之功效，為苦碟子(碟脈靈)注射液的原料藥材?？嗟幼⑸湟壕哂谢钛雇?、清熱祛瘀的作用[1]，臨床常用于瘀血閉阻的胸痹、冠心病、心絞痛、腦梗死等。抱莖苦荬菜中的主要化學成分為黃酮類、有機酸類、核苷類、氨基酸類及倍半萜內酯類成分，研究表明其具有抗動脈粥樣硬化、擴張冠脈及降低冠脈血管阻力、抗腫瘤活性等藥理作用[2-5]。不同產地的抱莖苦荬菜各化學成分含量也有一定的差異，這些差異進而對藥效產生了直接影響，因而產生了道地藥材與非道地藥材之分[6]。有研究證明不同產地抱莖苦荬菜確實存在異質性的物質基礎[7]，隨著中藥注射液安全性備受關注，中藥注射液安全性再評價指導原則對中藥注射液原藥材的質量控制提出了明確要求，所以建立一個有效的中藥材質量控制方法就成為了迫在眉睫的任務，而中藥指紋圖譜作為現代中藥質量標準體系的核心技術，是多學科交叉、綜合技術手段對復雜物質組成體系質量穩定性進行評價的檢測方法[8-15]。抱莖苦荬菜質量標準收載于衛生部藥品標準[16]中，但因不同的檢測機構及企業所具有的實驗條件是不同的，故在具體實驗操作時可能存在儀器的不適用性等問題，故本實驗對不同產地的抱莖苦荬菜進行HPLC色譜分析，并進行了儀器適用性考察，在使用率最高的Agilent、Waters、Shimadzu三個型號的儀器上進行儀器精密度、方法重復性以及樣品穩定性驗證，均符合指紋圖譜分析方法學要求，最終建立了抱莖苦荬菜的對照指紋圖譜。

1 儀器與材料

Agilent Technologies 1200高效液相色譜系統(含四元泵，自動進樣器，柱溫箱，1260 DAD檢測器；美國Agilent公司)；Waters 2695高效液相液相色譜儀(含四元泵，自動進樣器，柱溫箱，2698 DAD檢測器；美國Waters公司)；Shimadzu LC-20AT液相色譜儀(含二元泵，自動進樣器，LC-20AT PDA檢測器；日本島津公司)；M320型外接柱溫箱(Tianjin Puxiang)。

乙腈(Sigma公司，美國，色譜純)；甲醇(Sigma公司，美國，色譜純)；磷酸(天津科密歐化學試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。腺苷對照品(批號：110879-200202)、菊苣酸對照品(批號：111752-200902)，均購買于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷對照品由通化華夏藥業公司提供，純度大于98%。抱莖苦荬菜藥材(通化華夏藥業公司提供)均經天津中醫藥大學王玉明專家鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜Ixerissonchifolia(Bge.)Hanc。樣品清單如表1所示。

表1 抱莖苦荬菜樣品清單

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備 取抱莖苦荬菜藥材10 g，去除泥土、樹枝、偽品等雜物及發霉、變黑、帶根的藥材，挑選時應注意保護花、葉等藥用部位，沖洗至凈，切成3～5 cm的段。加10倍量純凈水浸泡1 h，煎煮1 h，第二次加8倍量純凈水煎煮0.5 h，煎煮液合并，加純凈水配制成濃度為每1 mL相當于原生藥0.05 g的生藥提取液。取配制好的生藥提取液(0.05 g·mL-1)，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取腺苷、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和菊苣酸對照品適量，精密稱定，加甲醇-水(25∶75)配制成每1 mL含腺苷5 μg，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150 μg，菊苣酸60 μg的溶液，即得。所配制的溶液4 ℃保存。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Part No.WAT054275，Lot No.0294353071；檢測波長：260 nm；流動相：0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，洗脫梯度如表2所示；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

表2 抱莖苦荬菜指紋圖譜梯度洗脫程序

2.3 抱莖苦荬菜HPLC指紋圖譜共有峰及參照峰篩選

將3個不同產地的抱莖苦荬菜按照2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下的色譜條件測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2.0版，國家藥典委員會，2010)進行分析，獲得不同產地抱莖苦荬菜指紋圖譜疊加圖，自動指認共有峰，在已指認的共有峰中手動選擇與藥效相關的成分以及峰面積較高的9個成分為抱莖苦荬菜指紋圖譜的共有色譜峰。按照2.1.2項下方法制備對照品溶液，照2.2項下色譜條件進行測定，選擇腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個與藥效有關的成分為參照色譜峰，見圖1。

注：峰1.腺苷；峰2.木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰3.菊苣酸。圖1 Agilent儀器參照物色譜指紋圖譜

2.4 Agilent儀器方法學驗證

2.4.1 精密度試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件連續進樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.8%，精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.4%，樣品放置24 h穩定。

2.5 Waters儀器方法學驗證

2.5.1 精密度試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件連續進樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.8%，重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，樣品放置24 h穩定。

2.6 Shimadzu儀器方法學驗證

2.6.1 精密度試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件連續進樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，精密度良好。

2.6.2 重復性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，重復性良好。

2.6.3 穩定性試驗 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，樣品放置24 h穩定。

2.7 HPLC分析及數據導出

將19批藥材按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜方法用Agilent、Waters、Shimadzu三臺液相色譜儀分析檢驗，通過儀器自帶工作站處理并導出AIA格式色譜數據，儀器的積分參數設置為如下：

Agilent：Slope Sensitivity(斜率靈敏度)5，Peak Width(峰寬)0.05，Area Reject(最小峰面積)1，Height Reject(最小峰高)1；

Waters：閾值50，峰寬30，最小峰面積1000，最小峰高0；

Shimadzu：斜率2000，半峰寬5，最小峰面積/峰高 1000。

2.8 對照指紋圖譜建立

打開中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2.0版，國家藥典委員會，2010)，工作模式選擇生成對照，導入儀器所分析的原始數據；參照圖譜參數設置分別為：參照圖譜編號為S1，對照圖譜生成方法為中位數法，時間窗寬度默認為0.1；在多點校正模塊下選擇9個共有特征峰；峰匹配方式選擇Mark峰匹配；匹配完成后點擊生成對照，即可得到對照指紋圖譜，將所得的對照圖譜保存，以備分析檢驗時使用。點擊匹配數據和計算相似度按鈕，查看并保存匹配結果。抱莖苦荬菜對照指紋圖譜如圖2所示。

2.9 儀器適用性考察

2.9.1 Agilent 儀器 將19批藥材按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜方法用Agilent液相色譜儀分析檢驗，通過儀器自帶工作站處理并導出AIA格式色譜數據，儀器的積分參數設置為如2.4項所示，按照2.8項下的方法建立對照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖3所示，共有峰相對鋒面積如表3所示。

2.9.2 Waters儀器 將19批藥材按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜方法用Waters液相色譜儀分析檢驗，通過儀器自帶工作站處理并導出AIA格式色譜數據，儀器的積分參數設置為如2.5項所示，按照2.8項下的方法建立對照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖4所示，共有峰相對鋒面積如表4所示。

2.9.3 Shimadzu儀器 將19批藥材按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下所示的色譜方法用 Shimadzu液相色譜儀分析檢驗，通過儀器自帶工作站處理并導出AIA格式色譜數據，儀器的積分參數設置為如2.4項所示，按照2.5項下的方法建立對照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖5所示，共有峰相對鋒面積如表5所示。

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。圖2 抱莖苦荬菜對照指紋圖譜

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。圖3 Agilent儀器19批藥材匹配色譜圖

批號12345678913050010.102 0 0.066 6 0.042 5 0.309 5 0.138 2 0.092 4 1 0.848 6 0.170 1 13050020.115 8 0.059 0 0.051 5 0.339 0 0.125 5 0.077 2 1 0.876 2 0.196 2 13050030.097 0 0.061 2 0.049 0 0.351 8 0.096 9 0.076 5 1 0.839 1 0.172 5 13060100.093 7 0.056 9 0.041 7 0.338 9 0.101 8 0.074 0 1 0.800 1 0.105 8 14050010.089 8 0.040 4 0.043 8 0.238 5 0.088 6 0.051 2 1 0.701 8 0.125 0 14050020.162 9 0.098 6 0.087 3 0.376 9 0.196 5 0.096 0 1 0.742 3 0.166 9 14050030.302 2 0.185 2 0.124 8 0.391 2 0.220 9 0.211 9 1 0.735 5 0.194 2 14050040.123 4 0.058 2 0.058 3 0.384 7 0.127 1 0.077 4 1 0.884 1 0.146 4 14060100.114 9 0.080 5 0.055 5 0.441 2 0.136 5 0.063 5 1 1.067 0 0.141 5 14060120.095 1 0.052 6 0.047 0 0.376 3 0.156 2 0.066 0 1 1.063 00.123 1 15050010.100 5 0.062 7 0.054 8 0.282 3 0.080 7 0.035 4 1 0.638 8 0.142 3 15050020.177 4 0.125 2 0.127 2 0.370 6 0.103 3 0.035 9 1 0.876 3 0.190 5 15060030.099 0 0.071 3 0.041 0 0.249 3 0.095 6 0.056 0 1 0.682 4 0.137 2 15060040.116 1 0.064 7 0.054 0 0.326 0 0.129 1 0.086 0 1 0.898 3 0.161 9 16050010.164 8 0.083 6 0.095 3 0.421 7 0.130 3 0.080 8 1 0.970 3 0.150 9 16050020.077 4 0.041 5 0.045 6 0.251 5 0.105 5 0.059 9 1 0.549 2 0.119 1 16060030.352 8 0.249 3 0.265 1 0.617 5 0.197 2 0.083 4 1 0.767 4 0.188 9 16050040.083 2 0.054 6 0.050 7 0.233 1 0.075 0 0.024 1 1 0.425 6 0.159 9 16050060.070 7 0.043 2 0.027 5 0.330 10.104 6 0.062 1 1 0.906 3 0.148 4

圖4 Waters儀器19批藥材匹配色譜圖

批號12345678913050010.249 00.036 10.020 40.276 70.036 90.020 81 1.627 00.616 413050020.117 30.060 90.052 90.474 80.101 80.030 41 1.081 00.174 413050030.086 40.063 80.047 00.426 00.070 10.028 21 1.014 00.161 713060100.084 50.056 00.035 20.409 70.084 20.045 31 0.911 50.091 414050010.073 10.041 60.052 80.310 50.063 10.035 41 0.883 20.115 514050020.156 20.108 80.095 90.546 00.164 90.056 21 0.957 90.164 914050030.437 30.284 00.200 40.784 70.219 20.089 91 1.143 00.245 314050040.093 30.058 90.058 00.496 00.113 30.060 51 1.088 00.130 214060100.109 20.086 20.051 90.594 80.117 90.031 31 1.321 00.137 714060120.085 30.057 00.044 90.542 70.135 70.023 81 1.417 00.105 715050010.104 40.066 70.044 10.403 80.065 70.019 71 0.831 00.131 115050020.167 10.152 30.142 60.590 30.083 00.035 91 1.184 00.190 315060030.078 10.074 80.041 30.362 60.073 50.024 81 0.698 60.149 415060040.106 40.064 00.057 30.480 60.122 00.036 51 1.160 00.143 516050010.138 80.078 70.093 00.476 20.120 20.113 81 1.097 00.150 016050020.053 60.034 40.043 70.274 30.095 60.037 91 0.597 10.114 116060030.214 30.165 90.184 00.525 00.176 20.090 21 0.731 40.147 216050040.066 70.047 70.035 90.285 40.048 70.023 61 0.499 50.141 916050060.044 70.031 00.014 00.357 30.088 90.068 51 1.023 00.125 2

圖5 Shimadzu儀器19批藥材匹配色譜圖

批號12345678913050010.078 00.033 90.031 20.292 10.136 70.095 01 0.843 20.138 013050020.105 30.042 10.047 30.376 40.116 80.061 11 0.890 40.171 013050030.100 50.045 80.049 60.347 80.086 10.059 61 0.846 40.160 013060100.095 40.044 10.044 70.360 80.097 80.045 81 0.843 40.091 914050010.095 30.034 20.050 30.252 00.074 50.037 51 0.786 60.116 714050020.157 20.075 50.092 10.405 40.173 40.042 81 0.793 50.161 914050030.339 00.128 60.149 40.466 90.209 30.132 11 0.799 80.085 414050040.139 10.046 60.064 50.411 90.120 70.049 91 0.921 90.130 314060100.097 20.060 00.052 20.445 90.132 60.045 11 1.065 00.114 814060120.095 40.035 90.041 90.390 20.162 00.058 01 1.091 00.095 215050010.093 60.045 70.053 30.302 30.081 50.034 81 0.691 40.128 215050020.156 30.092 50.133 10.394 70.097 10.030 61 0.914 60.169 815060030.086 90.051 50.045 30.273 20.077 30.028 21 0.701 50.135 015060040.106 10.053 30.056 40.368 10.140 00.059 81 0.965 40.137 116050010.134 40.056 80.082 80.316 40.100 20.054 91 0.685 00.164 016050020.079 70.028 00.046 30.235 70.103 60.042 41 0.520 70.112 016060030.307 20.163 20.236 70.533 60.194 60.059 01 0.651 00.115 916050040.070 90.048 80.041 20.228 90.058 80.014 11 0.413 10.144 216050060.056 30.028 20.021 80.335 00.093 30.025 01 0.982 10.128 6

2.10 小結

Agilent、Waters和Shimadzu三臺儀器中19批藥材與對照指紋圖譜的相似度見表6。

表6 各批次藥材與對照指紋圖譜相似度結果

可見經Agilent、Waters和Shimadzu儀器分析的各批次藥材指紋圖譜中均出現了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個參照色譜峰保留時間一致的色譜峰，并出現了9個共有峰，以1(S)、2、3、4、5、6、7(S)、8(S)、9號峰為標記，經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件計算，與對照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.95。

3 討論

本實驗建立了抱莖苦荬菜的HPLC指紋圖譜，綜合抱莖苦荬菜中與藥效相關的黃酮類、氨基酸類、有機酸類及核苷酸類成分的吸收波長，選擇各類成分均有吸收的波長，最終確定檢測波長為260 nm；并進行了儀器精密度、方法重復性、樣品穩定性以及儀器適用性驗證，符合指紋圖譜分析方法學要求。目前對于中藥材指紋圖譜的研究已經非常廣泛，但針對不同儀器間的差異進行考察的還鮮有報道，但眾所周知不同儀器的檢測結果會有一定差異，故本實驗對來自天津薊縣、遼寧海城、河北玉田的19個批次藥材在Agilent、Waters和Shimadzu三臺儀器中進行指紋圖譜檢測，均出現了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個參照色譜峰保留時間一致的色譜峰，并指認了9個共有峰，經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件計算，與對照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.95，說明所建立的對照指紋圖譜可以用于不同儀器的抱莖苦荬菜指紋圖譜分析檢驗，為該藥材的質量鑒定及真偽鑒別奠定了基礎，具有很強的實用價值。本實驗中用到的三個產地的抱莖苦荬菜都是道地藥材，故雖相似度有所差異但都符合要求，后期可用本實驗建立的指紋圖譜對其他地區的抱莖苦荬菜進行檢測，作為其真偽鑒別的依據。