傣藥人面果葉中總黃酮含量測定方法研究△

劉慧，鐘芳芳，譚雪，盧青秀，楊光忠，陳玉*

(1.中南民族大學 化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074；2.溫州市洞頭區產品質量監督檢驗所，浙江 溫州 325000；3.中南民族大學 民族藥學國家級實驗教學示范中心，湖北 武漢 430074)

人面果Garciniaxanthochymus是藤黃科Guttiferae植物，是我國傳統傣藥，有驅蟲、清熱解毒、解食物中毒等功效[1]。人面果果實、根部及樹葉化學成分主要含有黃酮[2-4]，三萜[5]和酮[6-8]等化合物，樹葉中含有大量的黃酮化合物，其中雙黃酮類化合物為其主要的結構類型，如Volkensiflavone、藤黃雙黃酮、3，8″-雙柚皮素、白果素、Fukugiside、GB2a glucoside、Fukugetin等[9]。本研究前期已經發現人面果葉乙酸乙酯提取物有較好的抗糖尿病活性[10]，雙黃酮類化合物Fukugetin(結構式如圖1)作為人面果葉抗糖尿病的活性成分，對α-淀粉酶有較強的抑制作用，并且是一種新的糖原合成酶GSK-3β的抑制劑，有降血糖的功效[11-12]，可選Fukugetin作為人面果葉藥材質量標準的指標性成分和總黃酮含量測定的對照品。

圖1 化合物Fukugetin的結構式

總黃酮的含量測定一般采用比色法、高效液相色譜法等方法[12]。比色法是《中華人民共和國藥典》中常見的總黃酮測定方法，其中以蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法最為常用[13]。本實驗將NaNO2-Al(NO3)3-NaOH與AlCl3-CH3COONa/CH3COOH比色法進行對比，在以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進行試驗時發現樣品顯色后穩定性差，不宜作為測定方法，故對AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法進行研究，對顯色前后的吸收峰(200～900 nm)進行比較，分析了以蘆丁和Fukugetin為對照品的AlCl3-CH3COONa /CH3COOH比色法測定人面果葉總黃酮的合理性，并對pH值，緩沖液濃度、顯色溫度等條件進行優化研究。因而建立葉中總黃酮含量的測定方法，對人面果葉制備工藝及質量標準的研究提供依據。

1 材料與儀器

美普達紫外分光光度計UV1800C(上海美普達儀器有限公司)；CP224C萬分之一電子天平(上海奧斯豪儀器有限公司)；島津AUW120D十萬分之一電子天平(島津分析天平有限公司)；亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、冰醋酸、氯化鋁、乙醇均為分析純(購自國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水；人面果葉采自云南西雙版納，經云南西雙版納民族醫藥研究所趙應紅主任藥師鑒定為藤黃科藤黃屬植物人面果Garciniaxanthochymus葉；對照品Fukugetin自制，純度達到98%，其結構經過1H、13C-NMR和ESIMS確定。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

稱量4.61 mg Fukugetin于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解定容至刻度(濃度為92.2 μg·mL-1)。

2.2 供試品溶液的配制

精密稱取干燥人面果葉粗粉0.1 000 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱重，水浴回流0.5 h，提取液冷卻，補足減失重量，過濾，取續濾液，即得。

2.3 兩種顯色方法的比較

2.3.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法(A)

2.3.1.1 顯色方法 用移液管移取對照品溶液1 mL于25 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白。在200～900 nm范圍內進行掃描，根據最大吸收峰確定測定波長，在510 nm附近有明顯凸躍[14-15](見圖2)。

圖2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法全波長掃描

2.3.1.2 穩定性 精密吸取Fukugetin對照品溶液、蘆丁對照品溶液、供試品溶液 各1 mL，按照上述同樣條件操作，顯色后的溶液每隔5 min測定吸收度。發現蘆丁在該條件下顯色后的溶液在1.5 h內都比較穩定，而供試品和Fukugetin溶液則很不穩定(見圖3)。因此該方法不適合作為人面果葉總黃酮含量的測定方法。

圖3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色放方法的穩定性

2.3.2 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法(B)

2.3.2.1 顯色方法 分別移取Fukugetin對照品溶液、蘆丁對照品溶液、供試品溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入0.1 mol·L-1AlCl32 mL、pH 5.2的CH3COONa/CH3COOH緩沖液3 mL，最終用乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下放置15 min。在200～500 nm區間內進行波長掃描[16]，根據最大吸收峰確定測定波長(見圖4)。由圖可見供試品和Fukugetin在415 nm處有最大吸收，而蘆丁則在425 nm處有最大吸收波長，更宜選定Fukugetin作為對照品。

圖4 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法顯色后全波長掃描

2.3.2.2 穩定性 精密吸取Fukugetin對照品溶液1 mL，供試品溶液1 mL，按照上述顯色方法進行顯色后，每隔5 min測定其吸收度，比較在一段時間內吸光度變化情況。在研究過程中發現醋酸鈉濃度、緩沖液pH、及緩沖液用量均對吸光度穩定性有影響，于是對醋酸鈉濃度、緩沖液pH、及緩沖液用量進行考察，選取最優的顯色條件。

2.4 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法的優化

2.4.1 醋酸鈉濃度考察 精密吸取對照品溶液4份各1 mL，按2.3.2.1項下顯色方法操作，分別采用0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-1醋酸鈉配制成的pH 5.5的緩沖溶液，測定415 nm 處吸光度，結果顯示1.0 mol·L-1醋酸鈉吸收穩定性較好(表1)。

2.4.2 緩沖液pH考察 精密吸取對照品溶液4份各1 mL，按2.3.2.1項下顯色方法操作，分別添加pH 4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖溶液。分別測定415 nm 處吸光度，結果顯示pH為4.0時在415 nm處未見明顯最大吸收(見圖5)。隨著緩沖液pH增加在415 nm處的吸光度逐漸增加，但穩定性逐漸降低(表2)。再比較pH 5.1、5.2、5.3、5.4、5.5時在415 nm處的吸光度穩定性，發現在pH為5.2時的穩定性較好，所以最終選取pH 5.2的緩沖液。

圖5 pH為4時AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法顯色后全波長掃描

2.4.3緩沖液用量考察 精密吸取對照品溶液3份各1 mL，按2.3.2.1項下操作，分別采用1、2、3 mL pH 5.2的緩沖溶液，測定415 nm 處吸光度，結果顯示當加入3 mL緩沖液時吸光度值最大，且具有較好的穩定性(表3)。

表1 醋酸鈉濃度對吸光度穩定性的影響

表2 緩沖液pH對吸光度穩定性的影響

表3 緩沖液用量對吸光度的影響

綜上所述，最終確定緩沖液測定的最佳條件為1.0 mol·L-1的pH值為5.2的醋酸鈉-醋酸緩沖液3 mL。

2.5 方法學考察

2.5.1標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL容量瓶中，濃度分別為0.046 1、0.092 2、0.138 3、0.184 4、0.230 5、0.276 6 mg·mL-1。分別按照2.3.2.1項下顯色方法測定415 nm 處吸光度，吸光度分別為0.146 0、 0.297 7、0.449 2、0.591 4、0.746 8、0.902 9。以對照品濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，在不同的用量范圍內分別呈線性，回歸方程Y=3.2687X-0.005 1(r=0.999 8)，雙黃酮Fukugetin在46.1～276.6 μg范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.5.2 精密度試驗

2.5.2.1 儀器精密度試驗 取同一份對照品溶液，在顯色15 min后連續測定6次吸光度值，分別為0.544 1、0.544 2、0.544 2、0.545 0、0.545 0、0.545 1，RSD值為0.088%，表明儀器精密度良好。

2.5.2.2 方法精密度試驗 對同一份供試品溶液分別取6份，顯色15 min后分別測定415 nm吸光度值，分別為0.532 4、0.532 0、0.533 9、0.539 7、0.534 9、0.544 1，RSD值為0.89%，表明該顯色方法精密度良好。

2.5.3重復性試驗 精密稱取人面果葉粗粉0.1 g共 6份，分別按2.2項下供試品溶液制備方法制備，按2.3.2.1項下顯色方法測定415 nm 處吸光度，并代入標準曲線計算含量，見表4。平均含量為4.07%，RSD 為1.2%，表明該方法重復性較好。

2.5.4顯色穩定性試驗 精密吸取Fukugetin對照品溶液1 mL，供試品溶液 1 mL，按2.3.2.1項下顯色方法測定415 nm 處吸光度，每隔5 min測定其吸收度。結果表明，對照品在60 min內穩定，供試品在 60 min 內基本穩定。

2.5.5加樣回收率試驗 精密稱取人面果葉粗粉約0.1 g，分別置于6個圓底燒瓶中，依次加入4.01 mg·mL-1對照品溶液各1.0 mL，無水乙醇24 mL，再按照2.2項下條件制備供試品，按2.3.2項下顯色方法測定415 nm 處吸光度，計算加樣回收率，結果如表4。能夠滿足分析要求，方法準確度較高。

表4 Fukugetin的回收率(n=6)

2.6 人面果葉中總黃酮的含量測定

精密稱定人面果葉粗粉0.1000 g，置100 mL容量瓶中，精密加入無水乙醇 25 mL稱重，70 ℃水浴中回流30 min，冷卻后稱重，用無水乙醇補充損失的溶劑重量(精確至 0.001 g)，搖勻，濾過，初濾液棄去，續濾液作為供試品溶液。精密吸取續濾液 1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.3.2.1項下顯色方法，按照紫外-可見分光光度法(《中華人民共和國藥典》2015版四部通則0401)，在415 nm 波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中總黃酮的濃度，進一步計算人面果葉中總黃酮平均含量為3.93%，結果見表5。

表5 人面果葉總黃酮含量

3 討論

本實驗對比了《中華人民共和國藥典》常用的方法：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法，發現NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法在顯色后樣品穩定性較差，不適合作為人面果葉總黃酮含量的測定方法。在進行AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法研究過程中，分別比較了以蘆丁和Fukugetin為對照品的顯色情況，發現Fukugetin的最大吸收波長能更好地與供試品重合，且Fukugetin系從人面果葉中分離得到的雙黃酮單體化合物，具有良好的降血糖作用，所以采用Fukugetin作為該法對照品，以提高方法的專屬性。優化了AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法的顯色條件，確立了人面果葉總黃酮含量測定方法，為后續人面果葉質量標準研究提供了依據。