不同年限及不同干燥方法的遼細辛中主要成分的含量測定△

張曉婉，黃健，宋冬梅，董育瑄，王晶，路金才，賈凌云*

(1.沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧和悅醫藥科技有限公司，遼寧 沈陽 110180)

遼細辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.為馬兜鈴科植物北細辛、漢城細辛的干燥根及根莖，主產于遼寧的撫順、丹東、吉林長白山以及黑龍江等地。細辛具有解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲等功效[1]。現代市場上常見的細辛干燥方法一般都陰干，該方法干燥時間長，不僅影響中藥草質量和經濟價值同時也直接影響產品的使用和外觀[2]。而細辛的主要化學成分包括甲基丁香酚、細辛脂素、黃樟醚、欖香素等揮發性成分以及木脂素類的細辛脂素和痕量的馬兜鈴酸[3-4]。其中馬兜鈴酸A在長期服用后可引起肝臟和腎臟的損壞與衰竭[5]，因此馬兜鈴酸的含量對于細辛藥材的安全性起到了關鍵的作用。因此，本文通過檢測甲基丁香酚、細辛脂素以及馬兜鈴酸三種成分為指標，對不同年限以及不同干燥方法進行分析比較，為完善細辛采收和后續加工方法提供科學依據[6]，3種成分的化學結構式見圖1。

圖1 馬兜鈴酸(a)、細辛脂素(b)、甲基丁香酚(c)結構式

1 儀器與材料

Waters 2707-2489-1525分析液相，WD900B型微波爐(輸出功率900W，額定微波功率2450 MHz，順德格蘭仕電器廠有限公司)，WS70-1型紅外線快速干燥器(功率500 W，電壓220 V，上海錦屏儀器儀表有限公司)，SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，BS124S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，KQ5200E型數控超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，高速多功能粉碎機(28000 r·min-1，上海緣沃工貿有限公司)，XMTH數顯控溫儀(浙江余姚市遠東數控儀器廠)，RE52CS旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

馬兜鈴酸A、細辛脂素對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，HPLC質量分數均大于98%，批號分別為wkq15122902、wkq16071301)，甲基丁香酚對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號為111642-200301)，甲醇(色譜純，山東禹王實業有限公司)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)。

野生遼細辛新鮮藥材于2017年9月，采自遼寧省撫順市北四平鄉，由沈陽藥科大學中藥學院賈凌云副教授鑒定為遼細辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.。

2 方法與結果

2.1 細辛的干燥品制備

測定所用的干燥品均用六年生遼細辛鮮品30 g進行干燥，以連續兩次干燥后稱重的差異小于5 mg為指標判斷干燥是否完全。不同干燥方法處理后的干燥品的質量約為14 g，最后確定的干燥時間為：陰干12 d、50 ℃烘干6 h、70 ℃烘干1.5 h、微波干燥4 min、紅外干燥1 h、凍干1 h。

2.2 HPLC法測定馬兜鈴酸、細辛脂素和甲基丁香酚的含量

2.2.1 馬兜鈴酸、細辛脂素和甲基丁香酚的色譜條件和系統適用性 色譜柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)為72：28等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：316 nm；進樣量：10 μL；柱溫30 ℃。在此色譜條件下，理論塔板數以馬兜鈴酸A計算不得低于5000，相鄰色譜峰的分離度應大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，色譜圖見圖2。

圖2 馬兜鈴酸對照品溶液色譜圖

色譜柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，?(A)55%～60%；10～15 min，φ(A)60%～65%；15～30 min，φ(A)65%～71%；30～35 min，φ(A)71%～55%；流速：1.0 mL· min-1；檢測波長：285 nm；進樣量：5 μL；柱溫30 ℃。在此色譜條件下，理論塔板數以細辛脂素計算不低于10 000，相鄰兩峰的分離度應大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，色譜圖見圖3。

圖3 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照儲備液 取馬兜鈴酸A 10.16 mg，置25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，再吸取1 mL置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，獲得濃度為40.64 mg·L-1的馬兜鈴酸A對照儲備液。另取甲基丁香酚10.53 mg，細辛脂素14.46 mg分置10 mL容量瓶，再分別取1 mL和0.5 mL的儲備液于10 mL的容量瓶中，分別獲得濃度為105.3 mg·L-1和72.3 mg·L-1作為細辛脂素和甲基丁香酚的混和對照儲備液。

2.2.2.2 供試溶液 取不同年限及不同干燥方法的遼細辛藥材粉末各1 g，置25 mL錐形瓶中，超聲提取3次，每次加5 mL分析甲醇。過濾后合并提取液，甲醇溶解并定量轉移至10 mL容量瓶中，過濾(0.22 μm)，取續濾液即為馬兜鈴酸的供試溶液。再取不同年限及不同干燥方法的遼細辛藥材粉末各0.5 g，置100 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，稱重。水浴回流1小時，取出，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失重量，過濾(0.22 μm)，取續濾液即為細辛脂素和甲基丁香酚的混合供試溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關系的考察 精密吸取馬兜鈴酸A對照儲備液0.5、1.5、2.5、3.5、5.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各吸取10 μL進行液相分析，再精密吸取“2.3.2.1”項下的對照品溶液1、2、4、8、10 mL細辛脂素和甲基丁香酚的混和對照儲備液，按照上述方法獲得系列標準溶液后，各吸取5 μL進行液相分析。以對照儲備液峰面積(A)為縱坐標，以溶液的質量濃度(ρ，mg·L-1)橫坐標，繪制標準曲線，得到馬兜鈴酸A的回歸方程為：A=1.433 5×104ρ+1.06×103，r=0.999 2；甲基丁香酚的回歸方程為：A=7×108ρ+4.431 62×105，r=0.999 2；細辛脂素的回歸方程為：A=2×109ρ+5.218 68×105，r=0.999 3結果表明，馬兜鈴酸A、甲基丁香酚以及細辛脂素的質量濃度分別在2.032～22.352 mg·L-1、10.53～105.3 mg·L-1及7.23～723 mg·L-1的濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取馬兜鈴酸對照儲備液10 μL及混合對照儲備液5 μL，在“2.2.1”條色譜條件下連續進樣6次，其馬兜鈴酸的RSD值為1.54%，細辛脂素和甲基丁香酚的RSD值分別為1.74%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 取六年生陰干的遼細辛藥材約1 g，按照“2.2.2.2”條方法平行制的6份供試溶液，按照“2.2.1”條色譜條件進樣分析，測得馬兜鈴酸A含量的RSD值為0.94%，另取六年生陰干的遼細辛藥材約0.5 g，同理測得其細辛脂素和甲基丁香酚的含量的RSD值分別為1.82%、1.14%，表明方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 取馬兜鈴酸供試溶液分別于0、2、4、6、8、12 h吸取10 μL注入液相色譜儀，按照“2.2.1”條色譜條件測定峰面積，測得馬兜鈴酸A峰面積的RSD值為1.14%，同理取細辛脂素和甲基丁香酚混合供試溶液以相同的時間點各吸取5 μL注入液相色譜儀，測得其細辛脂素和甲基丁香酚峰面積的RSD值分別為1.08% 、0.69%，表明供試品溶液在室溫下穩定性良好。

2.2.7 加樣回收率 稱取已知含量的遼細辛藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱定。按照“2.2.2.2”條方法制備供試溶液，并精密加入馬兜鈴酸對照儲備液適量，按照“2.2.1”條色譜條件進樣分析，計算馬兜鈴酸回收率，結果見表1。

表1 馬兜鈴酸A的加樣回收率的結果

再稱取已知含量的細辛藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定。按照同樣方法制備供試溶液，并精密加入混合對照儲備液適量，按照“2.2.1”條色譜條件進樣分析，計算回收率，結果見表2。

2.2.8 樣品含量測定 取不同年限和不同干燥方法的遼細辛藥材三份，按照“2.2.2.2”條方法制備供試溶液，在“2.2.2.1”的條件下，分別精密吸取不同年限和不同干燥的供試品溶液各10 μL進入液相，以外標一點法計算供試品中馬兜鈴酸的含量，并計算其他干燥品相對于六年生陰干中馬兜鈴酸的含量變化率，結果見圖3和圖4。

表2 細辛脂素和甲基丁香酚加樣回收率試驗結果(n=6)

圖4 不同年限馬兜鈴酸A的含量

圖5 不同干燥方法處理后馬兜鈴酸A的含量

再取不同年限和不同干燥方法的遼細辛藥材三份，按照上述同樣的方法制備供試溶液并分別吸取5 μL進入液相計算其甲基丁香酚和細辛脂素的含量及其他干燥品相對于六年生陰干中甲基丁香酚和細辛脂素的含量變化率，結果見表3和表4。

表3 不同年限中細辛脂素和甲基丁香酚的含量

表4 不同干燥方法處理后細辛脂素和甲基丁香酚的含量

3 討論與結論

細辛藥材中馬兜鈴酸的含量屬于痕量，因此考察了藥典及相關文獻[7-10]的檢測波長，結果表明馬兜鈴酸在316 nm處顯示有吸收，故選擇316 nm為檢測波長。

分別考察了流動相系統在梯度洗脫的條件下對細辛脂素和甲基丁香酚的分離情況，發現使用甲醇-0.1%甲酸水的系統梯度洗脫時分離度相對較好且峰型良好。故選擇采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫。

不同年限細辛中馬兜鈴酸A測定結果表明，馬兜鈴酸A的含量隨著年限的增長而下降，不同方法干燥處理后，馬兜鈴酸A的含量并未呈明顯的趨勢性變化且馬兜鈴酸A的含量均在國家藥典規定的0.001% 以下。

現今市場上流通的細辛藥材大多都采用陰干的方式來進行加工處理，本實驗結果表明采用冷凍干燥法對細辛藥材加工過程中有效成分的保留起到一定的作用，有條件的企業可以選擇此方法。此外，低溫干燥有效成分損失也較小，更適用大規模干燥。

細辛脂素和甲基丁香酚的含量隨著細辛種植年限越長，整體的含量也呈現逐年上升的趨勢，其中6年生的細辛藥材的有效成分含量要優于其他年限，但與5年生相差不大，考慮種植成本等因素，細辛的采收年限為5年較合理。