外源一氧化氮與水楊酸對鹽脅*迫下小麥幼苗生理特性的影響

張 倩 賀明榮 陳為峰 代興龍 王振林 董元杰? 諸葛玉平?

（1 山東農業大學資源與環境學院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東泰安 271018）

（2山東農業大學農學院，山東泰安 271018）

土壤鹽漬化是影響植物生長、導致農作物減產的主要因素之一［1］。鹽脅迫會引起植物形態、生理、生物化學等多方面變化［2］。高濃度NaCl會使植物根部土壤水勢降低，根系吸取水分困難從而產生滲透脅迫。同時鹽脅迫條件下葉片氣孔關閉，植物體內電子運輸與光合器官受損，導致光合作用及生產率下降。鹽脅迫同樣會使植物體內產生大量活性氧，造成脂類、蛋白質和氨基酸的氧化損傷，引起代謝紊亂，最終導致作物產量下降［3］。

一氧化氮（Nitric oxide, NO）和水楊酸（Salicylic acid, SA）是植物體內普遍存在的兩種小分子信號物質，且均在植物抵抗生物和非生物逆境脅迫反應中起重要作用［4］。SA與NO的信號應答途徑并非孤立的，二者在很多抗逆反應中均存在交互作用［5］。研究表明，SA能夠誘導擬南芥中NO的合成，且在一定范圍和時間內NO合成量隨SA濃度升高而增加［6］。而在煙草的系統獲得抗性信號通路中，NO活性完全依賴于SA功能作用［7］。Singh等［8］研究認為，NO與SA能夠協同調節植物體內亞砷酸鹽脅迫反應信號。在對NO和SA減輕紅花的鋅毒害作用的研究中發現，復合施用較單獨施用緩解毒害效果更加顯著［9］。此外，相關研究發現外源施加SA與NO均能緩解鎳對龍爪稷幼苗［10］及甘藍型油菜［11］的毒害作用，但其復配處理效果更具優勢。

小麥作為三大糧食作物之一，具有較高的營養價值。有研究顯示SA和NO能夠提高小麥中波紫外線脅迫抗性，且二者結合施用時效果最佳［12］。而有關外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗生長影響的相關研究尚少見報道。因此本試驗以小麥為研究對象，以硝普鈉（Sodium nitroprusside,SNP）為NO供體，研究鹽脅迫下外源NO和SA單獨及復合施用對其幼苗生長、光合色素合成及抗氧化酶系統的影響，以期了解外源NO、SA及其復合施用對鹽脅迫下小麥幼苗生長的緩解效應，并揭示其緩解機理，為鹽堿土壤上的小麥高產栽培和鹽漬化土地的開發利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年9月在山東農業大學資源與環境學院植物營養學實驗室進行。供試小麥（Triticum aestivum L.）品種“山農22號”，該品種為山東省栽培面積較廣的一種優質高產的小麥品種但耐鹽性較差。選取籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲害的種子，經0.1%的NaClO消毒10 min，然后用蒸餾水反復漂洗干凈，置于SPX-2501C型人工智能氣候箱中25℃下恒溫培養。待種子露白后，播于洗凈的濕潤蛭石中，萌發后用1/2 Hoagland營養液澆灌。待小麥長出兩片葉后挑選長勢一致的植株洗凈根部蛭石后，移栽至盛有1/2 Hoagland營養液的玻璃器皿中，每盆25株，營養液調pH至6.5～6.8，幼苗生長條件的室內晝/夜溫度為25/18 ℃，光強為100μmol·m-2·s-1，光照時間14 h·d-1。

1.2 試驗設計

試驗設6個處理：1) CK: Hoagland營養液處理；2) NaCl: Hoagland營養液+120 mmol·L-1NaCl；3) SA: Hoagland營養液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA；4) SNP: Hoagland營養液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SNP；5) 1/2(SA+SNP): Hoagland營養液+120 mmol·L-1NaCl+50 μmol·L-1SA +50 μmol·L-1SNP；6) SA+SNP : Hoagland營養液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA+100 μmol·L-1SNP，每個處理重復3次，每盆每次用250 mL 配制的混合液進行處理。每隔2 d換一次混合液，處理14 d后進行各項指標的測定。

1.3 測定項目及方法

鮮重和干重的測定：采取各部分植株樣，用去離子水將其沖洗干凈，再用吸水紙吸干，直接測定各部分鮮重（FW）。將新鮮材料放于105℃烘箱中殺青30 min后，在 70 ℃下烘干至恒重，然后測定植株干重（DW）。

光合色素含量的測定：用96%的乙醇將采取的幼葉研磨成勻漿，并在25 mL容量瓶內定容，搖勻后用分光光度計分別測定在665、649和470 nm下的吸光度值，然后利用相關公式計算出葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

電解質滲出率的測定：相對電導值(%)=第一次電導值/殺死后電導值×100%；

電解質滲出率(%)=（樣品相對電導值－對照相對電導值）/（100%－對照相對電導值）×100%。

N、P、K、Na、Ca、Mg含量測定：植株樣品經烘干、研磨過篩后，H2SO4-H2O2消化，凱氏定氮法測定全氮含量、鉬銻抗比色法測定全磷含量，火焰光度計法測定全鉀、全鈉含量。植株Ca、Mg含量采用HNO3-HClO消煮，并用原子吸收分光光度計進行測定［13］。

H2O2含量測定：參照Patterson等［14］的方法，采用三氯乙酸（Trichloroacetic acid, TCA）進行冰浴研磨，低溫離心后加入磷酸緩沖液和KI溶液于390 nm下進行比色測定。

抗氧化酶活性的測定［15］：取樣品加入磷酸緩沖液冰浴研磨，低溫離心后超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性測定采用氮藍四唑（Nitro-blue tetrazolium, NBT）法，過氧化物酶（Peroxidase, POD）活性測定采用愈創木酚法，過氧化氫酶（Catalase , CAT）活性測定采用紫外吸收法。

1.4 數據處理

采用Excel 2003軟件處理數據和繪表，采用DPS 7.05軟件進行統計分析，采用最小顯著極差法（LSD）進行差異顯著性檢驗（P ＜ 0.05）。

行動主張：建議學院優先從教學管理組織結構進行控制，強調及加強教研室的管理功能，加強教師團隊建設及對教師個人能力提升的支持與鼓勵，當然也應建立相應淘汰機制。教學單位應合理安排好課程結構，結合學院硬件實施（以及及時申購或添置必要實訓設施）、學生層次，設置好課程任務，在課程實施過程中，以師帶徒，提高學生能力及加強學院學風建設。

2 結 果

2.1 不同處理對小麥幼苗干鮮重及根系活力的影響

由表1可知NaCl處理顯著抑制小麥幼苗的生長。與CK相比，NaCl處理下小麥幼苗的地上部鮮重和干重分別降低45.65%和6.46%，地下部鮮重和干重分別降低55.80%和12.44%，且差異顯著。添加外源NO或SA之后都能夠緩解鹽脅迫，二者的復合處理也可以提高小麥幼苗的地上部和地下部鮮重及干重。其中1/2(SA+SNP)處理地上部鮮重及干重較NaCl處理分別增加67.34%和6.80%，地下部鮮重及干重分別增加76.91%和17.61%，且差異顯著，可見其效果最明顯。

表1 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗干鮮重及根系活力的影響Table 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on fresh or dry matter weight and root activity of the wheat seedlings under salt stress

根系活力是根生命力強弱的綜合評價指標，反映植物根系的整體發育狀況。由表1可知，與CK相比，NaCl處理可顯著降低小麥幼苗的根系活力。SNP 和SA單獨處理小麥幼苗根系活力分別較NaCl處理提高52.34%、47.56%； SNP和SA復合處理下其根系活力分別較NaCl處理提高74.26%、61.94%，且差異顯著。說明外源NO、SA及其復合處理在鹽脅迫下均可促進小麥幼苗根系的生長，提高其根系活力，從而促進植株對營養物質的吸收以及地上部的良好生長，且以1/2(SA+SNP)交互作用效果更明顯。

2.2 不同處理對小麥幼苗葉片光合色素含量的影響

由表2可見，鹽脅迫顯著降低小麥幼苗葉片光合色素的含量。與CK相比，NaCl處理的葉綠素a (Chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b(Chlorophyll b, Chl b)和類胡蘿卜素(Carotenoid, Car)的含量分別降低16.98%、17.86%、5.03%。隨著SNP或SA的添加，Chl a、Chl b和Car 的含量均有明顯的提高。其中1/2(SA+SNP)處理提高的幅度更大，且與NaCl處理差異顯著，其Chl a、Chl b和Car的含量較NaCl處理分別提高39.58%、24.46%、33.06%。表明NaCl處理對小麥幼苗產生脅迫，而外源N O與S A可以緩解這種脅迫，尤其是1/2(SA+SNP)的復合處理對鹽脅迫的緩解效果更明顯。

2.3 不同處理對小麥幼苗產生速率和H2O2含量的影響

圖1 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗超氧陰離子產生速率（A）及過氧化氫含量（B）的影響Fig. 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on generation rate (A) and H2O2 content (B) of the wheat seedlings under salt stress

表2 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合色素含量的影響Table 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on chlorophyll contents in leaves of the wheat seedlings under salt stress/(mg·g-1 FW)

22變化趨勢類似，NaCl處理下顯著提高，添加SNP和SA均可降低鹽脅迫下H2O2且差異顯著，其中1/2(SA+SNP)處理H2O2的累積量降低最為明顯。

2.4 不同處理對小麥幼苗丙二醛含量和電解質滲出率的影響

鹽脅迫誘導丙二醛（MDA）的積累，促進膜脂過氧化對小麥幼苗的傷害（圖2A）。與CK相比，NaCl處理下小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量分別提高38.95%、56.29%。添加SNP或SA均可以起到緩解效應，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量顯著降低，分別降低15.78%、24.23%，表現出更好的緩解效果。

鹽脅迫處理下小麥幼苗的電解液滲出率均顯著升高（圖2B）。與CK相比，NaCl處理的電解液滲出率提高70.72%。而添加SNP或SA均可以顯著降低電解質滲出率，并且SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯，與其他3個處理相比也具有顯著差異。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗的電解質滲出率降低32.50%，表現出更好的緩解效果。

2.5 不同處理對小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）的活性在NaCl處理下顯著降低（圖3A）。與CK相比，NaCl處理使小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別降低18.67%、41.79%。添加SNP或SA可以緩解鹽脅迫造成的SOD活性降低，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性顯著提高，分別提高14.49%、21.53%，表現出最好的緩解效果。為適應鹽脅迫，NaCl處理下小麥幼苗的過氧化物酶（POD）活性顯著提高（圖3B）。與CK相比，其葉片和根系中的POD活性分別提高10.86%、12.11%。隨著SNP和SA的添加，各處理均顯著提高小麥幼苗的POD活性，起到緩解鹽害的作用，其中SNP和SA復合處理的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別提高9.12%、7.34%，具有顯著差異，表現出最好的緩解效果。

圖2 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗丙二醛含量（A）及電解質滲出率（B）的影響Fig. 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on MDA content (A) and electrolyte leakage (B) of the wheat seedlings under salt stress

圖3 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗SOD（A）、POD（B）及CAT（C）酶活性的影響Fig. 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on SOD (A), POD (B) and CAT (C) activity of the wheat seedlings under salt stress

2.6 不同處理對小麥幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸在植物體內的含量在一定程度上反映植物的抗逆性。由圖4可知，在鹽脅迫條件下，脯氨酸含量增加，從而小麥幼苗更好地適應鹽脅迫逆境。隨著SNP和SA的添加，進一步提高了小麥幼苗的脯氨酸含量，起到緩解鹽害的作用，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更為明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的脯氨酸含量分別增加了6.62%、35.55%，差異顯著，表現出更好的緩解效應。

圖4 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on proline content of the wheat seedlings under salt stress

2.7 不同處理對小麥幼苗體內Na及其他礦質元素含量的影響

由表3可知，在NaCl處理下，小麥有幼苗葉片和根系中的Na含量顯著增加，分別較CK增加2.67倍和3.57倍。添加外源SNP與SA之后，Na含量有所下降，尤其是1/2(SA+SNP)處理Na含量顯著下降。可見1/2(SA+SNP)處理抑制了小麥對Na的吸收。

N、P、K、Ca、Mg的含量在NaCl處理條件下降低，說明過量的Na抑制這些礦質元素的吸收。然而添加外源SNP或SA或SNP+SA可以緩解N、P、K、Ca和Mg含量的降低，并促進小麥幼苗對這些礦質元素的吸收。其中，1/2(SA+SNP)處理結果差異顯著。與NaCl相比，1/2(SA+SNP)處理條件下，N在葉和根中的含量分別增加15.49%、27.30%；P在葉和根中的含量分別增加23.04%、21.40%；K在葉和根中的含量分別降低3.08%、97.78%；Ca在葉和根中的含量分別降低45.07%、110.12%；Mg在葉和根中的含量分別降低15.85%、18.87%，且均具有顯著差異。

表3 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗礦質元素含量的影響Table 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on mineral elements content of the wheat seedlings under salt stress /(mg·kg-1)

3 討 論

3.1 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗干鮮重、根系活力及光合色素含量的影響

Tariq等［16］研究表明鹽脅迫會抑制植物的光合作用、養分平衡、抗氧化酶活性、可溶性物質積累等多種生理過程，進而抑制植株生長。而NO和SA作為生長調節物質可以參與逆境脅迫的多重生理調控。本試驗結果顯示NaCl處理降低小麥幼苗的干重及鮮重，而添加外源物質可以緩解這種影響，并且SNP與SA復合處理條件下小麥的鮮重和干重較單獨施用效果更好，尤其是1/2(SA+SNP) 效果更優。通過測定小麥的根系活力、葉片的葉綠素含量，可以看出SA+SNP顯著提高了鹽脅迫下小麥的根系活力和葉綠素含量。SA+SNP可以通過提高根系活力來促進小麥對礦質元素的吸收，也可以通過促進葉綠素的合成來提高小麥的光合作用，進而對鹽害有很大的緩解作用。有研究表明，外源添加NO和SA能夠有效修復亞砷酸鹽對水稻根系生長及葉綠素合成的抑制作用［8］，這與本研究結果一致。此外，SNP和SA對鹽害的緩解作用還可能是因為對膜功能和抗氧化劑的保護作用。

3.2 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗丙二醛含量和電解質滲出率的影響

在本研究中，N a C l處理增加了小麥幼苗的膜脂過氧化作用，而外源NO和SA，尤其是1/2(SA+SNP)，顯著降低了MDA積累。Gunes等［17］研究表明SA可以通過抑制OH-的合成來降低MDA的含量；此外NO可以通過降低和H2O2的積累來降低膜脂過氧化作用［18］。鹽脅迫對植物的另一直接毒性作用表現為過量的Na造成了細胞膜電解質滲出率增加。鹽脅迫下MDA含量和電解質滲出率的增加會導致小麥的生理生化功能衰退，最終阻礙植株生長。試驗表明外源添加SNP和SA可以降低小麥幼苗的電解質滲漏率和MDA含量，其中以1/2(SA+SNP)效果更優。Bastam等［19］研究表明SA可通過促進對離子的吸收和提高抗氧化能力來維護膜功能，從而保護植物免受氧化損傷。外源添加SA和SNP降低電解質滲漏率可能是由于減緩了生物膜的過氧化作用，從而減輕了鹽脅迫下小麥質膜受損程度。

3.3 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

3.4 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響

本研究測定了鹽脅迫對滲透調節物質含量的影響。在NaCl處理下，外源添加SNP和SA，可以提高小麥幼苗葉片和根系中脯氨酸的含量， 以1/2(SA+SNP)處理效果更好。這可能是由于NO與SA通過促進脯氨酸生物合成的基因表達來影響脯氨酸濃度。有研究表明脯氨酸可以通過和生物大分子（比如DNA、蛋白質）相互作用清除羥自由基，從而穩定生物大分子的結構。Tan等［18］表明NO與SA可以通過誘導脫落酸合成來調節脯氨酸的含量，從而緩解滲透脅迫。因此可以推斷，鹽脅迫下NO與SA對滲透物質的調節作用可能是其保護小麥幼苗免遭鹽害的原因之一。

3.5 外源NO與SA復合調控對鹽脅迫下小麥幼苗體內Na及其他礦質元素含量的影響

有研究表明植物對鹽脅迫的主要反應是減少K的含量，Na替代K的吸收從而導致營養失衡［23］。在本研究中，NaCl處理增加了小麥幼苗葉片和根系中Na的含量，降低了其它礦質元素（N、P、K、Ca、Mg）的含量。這可能是由于離子間存在競爭排斥作用，高濃度的Na+和Cl-競爭排斥了其他離子的吸收，從而導致小麥礦質養分含量降低。而研究結果表明SNP和SA的復合施用可以促進N、P、K、Ca、Mg元素的吸收，從而提高這些礦質元素在地上部的積累。同樣，SA+SNP可以通過提高對其他元素的吸收來降低對Na的吸收。可見SA+SNP可以改善鹽脅迫誘導的礦質營養失衡，從而促進小麥幼苗的生長。

4 結 論

與單獨添加SNP或SA相比，SA+SNP復合處理更能顯著提高鹽脅迫下小麥幼苗葉綠素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低產生速率、H2O2和MDA含量以及電解質滲漏率；提高小麥根系活力，促進其對N、P、K、Ca等礦質營養元素的吸收，同時抑制了Na的吸收，減少小麥體內的Na含量，從而緩解了鹽脅迫對小麥生長的抑制作用。本研究條件下，各處理中以1/2(SA+SNP)處理的緩解小麥鹽脅迫的效果最優。