高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥對連作土壤微生物環境及再植平邑甜茶幼苗生長的影響

徐少卓，王曉芳，陳學森，沈 向，尹承苗，毛志泉

（山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

我國是蘋果生產第一大國，近年來，隨著蘋果集約化生產的不斷發展以及矮化密植技術的持續推廣，蘋果再植病問題愈發嚴峻[1]，因此尋找減輕蘋果連作障礙發生的有效措施具有重要意義。造成蘋果連作障礙發生的原因很多，大多數研究認為，長期連作土壤中有害真菌數量的增多、微生物群落結構的改變以及連作土壤中酚酸類物質含量的升高是造成蘋果連作障礙發生的主要原因[2–3]。

高錳酸鉀 (KMnO4) 屬于無機氧化劑，具有強氧化性，因此有很強的殺菌、消毒、防腐保鮮能力，常用作消毒劑、水凈化劑等。相比于其他氧化劑，高錳酸鉀藥源豐富，成本低，而且使用時對人畜安全、無毒，對作物無殘留、無藥害，對環境無污染，因此也被稱為綠色氧化劑[4]。農業生產實踐表明，用適宜濃度的高錳酸鉀溶液進行種子消毒、葉面噴霧和灌根，對瓜果蔬菜立枯病、炭疽病、根腐病等有非常顯著的防治效果。李伶俐等[5]在棉花栽培地中噴施高錳酸鉀溶液，使棉花的產量、品質得到提升；劉星等[6]研究將高錳酸鉀作為馬鈴薯塊莖的消毒劑。本課題組前期研究發現，高錳酸鉀不僅具有殺菌、消毒功能，并且還可以氧化分解根皮苷、根皮素等酚類物質[7–8]，而根皮苷是造成蘋果連作障礙發生的主要酚類化合物。此外，有研究表明適量添加Mn2+對植物的生長也具有積極的意義[9]。因此，在老齡蘋果園土壤中施用適量高錳酸鉀既可以降低土壤中的有害微生物數量，而且還能氧化分解連作土壤中酚類物質，這對減輕蘋果連作障礙具有重要的意義。

木霉菌 (Trichoderma spp．) 是一種廣泛存在于自然界且具有重要價值的植物病害生防菌，并且木霉菌無毒、無污染，用于作物土傳病害的生物防治無明顯風險，隨著人們環保意識的增強，木霉生防菌已逐漸成為研究熱點[10]。Azarmi等[11]研究認為木霉菌可以促進番茄幼苗的生長，并且能夠提高番茄幼苗對營養元素的吸收；Asaduzzaman等[12]將辣椒種子用木霉菌液浸泡后，其萌發率顯著提高，并且促進了辣椒幼苗的生長；馮程龍等[13]以小麥秸稈為載體生產的木霉生物有機肥顯著提高了黃瓜產量。對連作障礙的研究中，康萍芝等[14]發現，施用哈茨木霉制劑能明顯改善設施連作番茄根際土壤微生態環境，減輕番茄枯萎病發生，促進番茄植株生長；袁玉娟等[15]認為，哈茨木霉T37菌種可以顯著降低設施黃瓜連作土壤中尖孢鐮孢菌數量，并提高黃瓜產量。本課題前期研究發現，平邑甜茶幼苗與蔥短期輪作條件下施用木霉菌肥后，可以顯著改善連作土壤微生物環境，提高平邑甜茶幼苗生物量[16]。

本研究采取老齡蘋果園土壤再植幼苗前進行高錳酸鉀消毒，定植幼苗時施入木霉菌肥，擬通過兩種方式的聯用來增加對病原菌抑制的持續性以及改善連作土壤的微生物環境，完善其合理的營養配比，從而為減輕蘋果連作障礙提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年4—10月在山東農業大學園藝科學與工程學院、國家蘋果工程技術中心、作物生物學國家重點實驗室進行，試驗用土為山東省泰安市滿莊鎮小王莊村27年生老齡蘋果園土，取自距樹干80 cm、去表層土后深20—40 cm的區域，多點隨機取樣，混勻備用。土壤類型為棕壤，土壤容重1.27 g/cm3、土壤pH值5.17、-N 6.2 mg/kg、-N 4.5 mg/kg、速效鉀88.2 mg/kg、有效磷10.1 mg/kg、有機質9.64 g/kg。

供試材料為蘋果砧木品種平邑甜茶 (Malus hupeheusis Rehd.) 實生苗。將平邑甜茶種子于4℃層積30 d，種子露白后，播種于育苗培養缽中。待幼苗長至6片真葉時，取長勢基本一致的幼苗進行移栽。

高錳酸鉀為固體，分析純，施用濃度為0.1‰(W∶W)。

木霉菌肥由德州創迪微生物資源有限公司提供，主要菌種為哈茨木霉 (Trichoderma hazianum)。

1.2 試驗處理

高錳酸鉀滅菌在平邑甜茶定植前半個月 (本試驗于2017年4月13日) 進行，具體操作如下：將高錳酸鉀與老齡蘋果園土壤按比例 (0.1 g∶1 kg) 混合均勻，裝入泥盆中 (上部內徑25 cm、下部內徑17 cm、高18 cm)。再用水澆灌直至盆中上層土壤達到飽和。

在栽植前一天，將經過高錳酸鉀滅菌的土壤倒出并與木霉菌肥混合均勻，裝入盆中，適當澆水。設置4個處理：CK，老齡蘋果園土壤；T1，老齡蘋果園土壤增施木霉菌肥；T2，高錳酸鉀處理老齡蘋果園土壤；T3，老齡蘋果園土壤經高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥。2017年5月1日，各處理 (每個處理15盆，每盆裝土7 kg) 統一栽植平邑甜茶幼苗，每盆定植2株，正常肥水管理。7月15日、8月15日、9月15日分3次取樣品測定，每個處理取平邑甜茶幼苗3株，洗凈后測定其生物量指標。9月15日在取平邑甜茶幼苗的同時，取土樣，取樣時去除表層與盆周圍土，每個處理隨機選取3盆，作為3個重復，分別過2 mm篩，及時放入–80℃冰箱，提取土壤DNA，后續進行q-PCR、T-RFLP分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 老齡蘋果園土壤基礎理化性質的測定 有機質、氮、磷、鉀測定參照鮑士旦《土壤農化分析》第三版的方法，有機質—重鉻酸鉀容量法 (稀釋熱法) ；速效磷 (P2O5) —鉬銻抗比色法；速效鉀 (K2O) —火焰光度法；銨態氮和硝態氮 (-H和-N) —CaCl2浸提流動注射分析儀法[17]。

1.3.2 生物量測定 平邑甜茶幼苗株高、地徑分別用米尺和游標卡尺 (上海申工) 測定，干、鮮質量用電子天平 (上海舜宇恒平) 測定。

1.3.3 根系呼吸速率測定 根系呼吸速率測定采用Oxy -Lab氧電極自動測定系統，參照毛志泉等[18]的方法測定。

1.3.4 根系抗氧化酶活性測定 超氧化物歧化酶(SOD) 活性測定參照Zhang等[19]的方法，以抑制氮藍四唑 (NBT) 光還原50%為1個酶活力單位 (U)，用U/g, FW表示。過氧化物酶 (POD) 活性測定按Omran[20]的方法，測定470 nm吸光度的變化，以每分鐘內引起 470 nm吸光度變化0.01的酶量為1個酶活力單位(U)，用U/(g·min), FW表示。過氧化氫酶 (CAT) 活性的測定按照Singh等[21]的方法。測定240 nm吸光度變化，以每分鐘內使240 nm吸光度減少0.1的酶量為1個酶活力單位 (U)，用U/(g·min), FW表示。

1.3.5 葉片光合參數的測定 采用美國P-Systems公司生產的Ciras-3型光合儀測定光合速率及相關參數。8月23日10:00 左右 (天氣晴朗) 各處理選取3株平邑甜茶幼苗，每株幼苗選取自下而上第3～5片完全展開的、有代表性的健康成齡葉，固定葉片并做標記，測定凈光合速率 (Pn)、蒸騰速率 (Tr)、氣孔導度 (Gs)、胞間CO2濃度 (Ci)。

1.3.6 土壤總DNA提取及熒光定量分析 土壤DNA的提取參考E.Z.N.ATM土壤DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek Omc. USA) 說明書操作。實時熒光定量采用CFX96TMThermal Cycler (Bio-Rad) 對土壤中層出鐮孢菌 (Fusarium proliferatum) 和尖孢鐮孢菌 (F.oxysporium) 基因拷貝數進行絕對定量分析。實時熒光定量PCR體系依據SYBR Premix Ex TaqTMKit TaKaRa試劑盒說明步驟完成。

25 μmL PCR 反應體系：DNA 模板 1.5 μmL；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μmL；引物各 1 μmL；ddH2O 9 μmL。

層出鐮孢菌PCR擴增反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s。共計40個循環。

尖孢鐮孢菌PCR擴增反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；65℃退火30 s。共計40個循環。

1.3.7 T-RFLP圖譜分析[22–23]用于真菌ITS片段擴增的引物采用帶FAM熒光標記的真菌通用引物ITS1-F-FAM和ITS4，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

ITS1-F-FAM：5’-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3’；

ITS4：5’- TCCTCCGCTTATTGATAGC-3’。

50 μL 真菌反應體系：25 μL Taq Master Mix；2 μL DNA模板；ITS1-F和ITS4各3 μL，加ddH2O 17 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性1 min (30 s)，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，共34個循環；最后72℃延伸10min。取5 μL ITSPCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用EasyPure PCR純化試劑盒 (北京全式金生物技術有限公司) 純化。將純化產物用限制性內切酶Fast Digest HhaⅠ進行酶切。30 μL酶切反應體系：10 μL ITS-PCR 純化產物；2 μL HhaⅠ；2 μL Buffer；16 μL ddH2O。反應體系于37℃保溫孵育15 min，將酶切產物送至上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2003、origin8.5進行數據整理，用SPSS 19.0進行方差分析，鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 不同處理對平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表1可以看出，3次取樣結果顯示老齡蘋果園土施木霉菌肥 (T1)、高錳酸鉀處理 (T2) 以及兩種方式的聯用 (T3) 均可以促進平邑甜茶幼苗的生長，其中以兩者聯用處理的促進效果最為顯著。以9月數據為例進行分析，9月份時，兩者聯用處理 (T3) 的平邑甜茶幼苗株高、地徑、鮮質量、干質量分別比連作對照 (CK) 提高了74.9%、73.2%、100.9%、92.3%，比木霉菌肥處理 (T1) 提高了34.0%、30.9%、34.9%、33.7%，比高錳酸鉀處理 (T2) 提高了22.5%、23.0%、21.7%、17.3%。

2.2 不同處理對平邑甜茶幼苗根系保護酶活性及根系呼吸速率的影響

由圖1可以看出，高錳酸鉀與木霉菌肥聯用處理 (T3) 的根呼吸速率，SOD、POD、CAT活性最高，其次為高錳酸鉀處理 (T2)、木霉菌肥處理(T1)、連作對照 (CK)。其中高錳酸鉀與木霉菌肥聯用處理 (T3) 的根呼吸速率，SOD、POD、CAT活性比連作對照 (CK) 分別提高了147.2%、145.1%、175.5%、81.3%，比木霉菌肥處理 (T1) 提高了41.7%、32.0%、39.8%、23.4%，比高錳酸鉀處理(T2) 提高了18.1%、17.6%、23.7%、11.9%。

表1 不同土壤處理對平邑甜茶生物量的影響Table 1 Plant biomass of Malus hupeheusis Rehd. in different orchard soil treatments

2.3 不同處理對平邑甜茶幼苗光合參數的影響

光合相關參數結果顯示 (圖2)，高錳酸鉀與木霉菌肥聯用處理 (T3) 對平邑甜茶幼苗凈光合速率(Pn)、蒸騰速率 (Tr)、氣孔導度 (Gs) 的提高幅度最為明顯，但對胞間CO2濃度的影響不顯著。該處理(T3) 下平邑甜茶幼苗凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度分別是連作對照 (CK) 的1.96、2.91、1.73倍。其次為高錳酸鉀處理 (T2)。

2.4 不同處理下尖孢鐮刀菌和層出鐮孢菌的基因拷貝數分析

圖3表明，木霉菌肥處理 (T1)、高錳酸鉀處理(T2) 以及兩者聯用 (T3) 均能顯著降低連作土壤中尖孢鐮刀菌、層出鐮孢菌的數量，以高錳酸鉀與木霉菌肥聯用處理 (T3) 對兩種致病菌的抑制效果最為明顯。相較于連作對照 (CK)，兩者聯用處理的尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum)、層出鐮孢菌 (F.proliferatum) 基因拷貝數分別降低了69.7%、64.4%，顯著高于木霉菌肥處理 (T1) 29.8%、29.3%以及高錳酸鉀處理 (T2) 50.0%、49.7%。

2.5 不同處理對老齡蘋果園土壤真菌群落結構的影響

根據不同處理間的T-RFs在圖譜中的分布及豐度進行主成分分析 (PCA) (圖4)，結果顯示，連作對照 (CK) 與木霉菌肥處理 (T1) 位于第一象限，而高錳酸鉀處理 (T2) 與高錳酸鉀木霉菌肥兩者聯用處理(T3) 的主成分均位于第四象限。并且兩者聯用處理(T3) 與連作對照 (CK) 的距離最遠，可見，高錳酸鉀與木霉菌肥聯用 (T3) 最顯著地改變了連作土壤的真菌群落結構，在連作障礙的研究中，一般認為土壤消毒引起的真菌群落結構的顯著變化往往有利于再植植株的生長, 更有利于減輕蘋果連作障礙。

3 討論

3.1 高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥對連作平邑甜茶幼苗生長的影響

圖1 不同處理對平邑甜茶幼苗根系根系呼吸速率及SOD、POD、CAT活性的影響Fig. 1 Effects of different treatments on root activity, SOD, POD and CAT of Malus hupeheusis Rehd.

連作會顯著抑制植株的生長發育，最直觀的表現為植株長勢變差，產量嚴重下降。且隨著種植年限的增加，抑制作用會逐漸加重[24]。在蘋果連作障礙的危害中，最突出的問題是幼苗成活率低、樹勢矮小、果實品質變差[25]。本研究表明，高錳酸鉀消毒、增施木霉菌肥以及兩者聯用均能促進平邑甜茶幼苗的生長，其中以高錳酸鉀消毒與木霉菌肥聯用處理效果最佳，此外，以高錳酸鉀作為土壤消毒劑來緩解連作問題還未見報道。從平邑甜茶幼苗植株的生理角度來看，兩者聯用顯著提高了平邑甜茶幼苗的根呼吸速率，增強了其凈光合速率以及蒸騰速率，進而促進了平邑甜茶幼苗的生長，使其株高、地徑、鮮質量、干質量相較于其他處理都有了顯著提升。其中的原因可能有兩方面，一是由于高錳酸鉀的強氧化性凈化了土壤環境，減少了有害微生物對平邑甜茶幼苗根系的侵染，并且此前也有研究認為高錳酸鉀的還原產物Mn2+、K+能夠激活植株中多種酶的活性，進而促進葉片的光合作用[5]。二是連作土壤經高錳酸鉀消毒后為木霉菌在連作土壤中的定殖提供了有利條件，而木霉菌屬于有益菌，有利于平邑甜茶幼苗的生長，并且有研究認為木霉菌也能夠調控某些生長激素、光合反應的基因表達從而促進糖代謝以及光合作用[26–28]。此外，由于木霉菌肥載體中存在大量有機質，這也為植株的生長提供了充足的營養。

圖2 不同處理對平邑甜茶幼苗葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度的影響Fig. 2 Effects of different treatments on the Pn, Tr, Gs and Ci of Malus hupeheusis Rehd.

圖3 不同處理連作土壤中尖孢鐮刀菌、層出鐮孢菌基因拷貝數Fig. 3 Copy numbers of Fusarium oxysporum and Fusarium proliferatum in soils under different treatments

圖4 不同處理間真菌 T-RFLP 圖譜主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of T-RFLP patterns of fungi in different treatments

3.2 高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥對連作平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影響

大多數研究表明，正常條件下，植株體內自由基的產生與消除保持動態平衡。當遇到逆境脅迫時自由基的產生速率遠遠大于其消除速率，此時植物便會受到傷害[29]。長期連作條件下，惡化的土壤環境便成為蘋果幼苗的逆境威脅，此時根系自由基存在的動態平衡便被打破，蘋果幼苗的生長便會受到威脅。SOD (超氧化物歧化酶)、POD (過氧化物酶)、CAT (過氧化氫酶) 三者是保護植物免受過量自由基傷害的主要參與者，三者的協同作用，共同保護植物體內膜結構，降低自由基對膜結構的傷害[30]。本研究發現，無論是高錳酸鉀消毒還是增施木霉菌肥以及兩種方式的聯用均能提高平邑甜茶幼苗根系的抗氧化酶活性。高錳酸鉀處理提高根系抗氧化酶活性的主要原因還是與強氧化殺菌凈化連作土壤微生物環境有關，這也與本課題前期研究結果相似[31]。木霉菌肥提高平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性與莊敬華等[10]、李艷娟等[32]的研究結果相同。從生理角度來說木霉菌肥作為有益菌、拮抗菌優化了連作土壤環境，減輕了連作土壤對再植植株的逆境脅迫，此外，也有研究從分子角度認為木霉菌與植物互作后可以激活促分裂原活化蛋白激酶MPK6 的活性，增加植物體內抗性蛋白含量，增強植物的系統抗性[33–34]，其中SOD、POD、CAT便是植株體內重要的抗性蛋白。可見，兩者聯用增強了平邑甜茶幼苗對逆境條件的抗性。

3.3 高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥對連作土壤有害真菌及真菌群落結構的影響

徐文鳳等[35]在我國環渤海蘋果重茬園中分離出大量鐮孢屬真菌，分別為尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum)、層出鐮孢菌 (F. proliferatum)、腐皮鐮孢菌 (F. solani)和串珠鐮孢菌 (F. moniliforme) 。本研究對連作土壤中的尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum) 與層出鐮孢菌 (F.proliferatum) 的基因拷貝數進行定量分析發現，高錳酸鉀消毒與木霉菌肥聯用對上述兩種真菌的抑制作用最為明顯，其次為高錳酸鉀滅菌處理、木霉菌肥處理。關于高錳酸鉀的殺菌作用，以前已有較多報道，而木霉菌的抑菌機理主要有2種，一是通過抗生、重寄生、溶菌、競爭作用來抑制病原菌生長，二是通過木霉菌誘導植株產生抗性機制來實現[36]。可見，連作土壤經高錳酸鉀消毒后，土壤中致病菌數量已有所降低，而木霉菌肥的施用又明顯抑制了病原菌的繁殖，兩者的聯用增強了對病原菌抑制的持久性。本課題組前期研究發現不同連作蘋果園的土壤真菌群落結構有明顯差異，并且土壤真菌構成一個獨立的群落結構[22]。本研究中我們通過對T-RFLP圖譜的主成分分析 (PCA) 發現，各處理均改變了連作土壤真菌群落結構，其中，高錳酸鉀與木霉菌肥兩者聯用對真菌群落結構的改變最為明顯，這更有利于減輕蘋果連作障礙。

4 結論

老齡蘋果園土壤經高錳酸鉀消毒后增施木霉菌肥能夠顯著降低土壤中真菌數量和改變群落結構，提高平邑甜茶幼苗的抗氧化酶活性，進而促進平邑甜茶幼苗的生長。本文僅在盆栽條件下研究了兩種方式的聯用對蘋果砧木平邑甜茶幼苗的影響，其實際應用效果還需進一步通過田間試驗進行驗證。