HPLC法同時(shí)測(cè)定心腦健片中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因的含量

付長(zhǎng)華 郞明洋

（花園藥業(yè)股份有限公司，浙江金華322121）

0 引言

心腦健片是從純天然綠茶中提取出茶葉提取物，再通過(guò)現(xiàn)代化中藥片劑成型工藝制備而成，其主要成分含茶多酚，具有清利頭目、醒神健腦、化濁降脂的功效，亦可用于心血管病伴高纖維蛋白原血癥及動(dòng)脈粥樣硬化，腫瘤放療、化療所致的白細(xì)胞減少癥的治療。

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，在茶葉中的含量一般在20%～35%。其中，兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65%～80%，兒茶素類化合物主要包括兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（EGC）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）4種物質(zhì)，其各組分含量EGCG為50%～60%、EGC為15%～20%、ECG為10%～15%和EC為5%～10%。EGCG是兒茶素類化合物中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%，因?yàn)镋GCG具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以它具有非常強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是維生素C的100多倍，是維生素E的25倍[1]，能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA，免受損害，對(duì)氧自由基的清除（抗氧化）能力強(qiáng)，常用作腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠改善癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性并減輕對(duì)心臟的毒性，在抗癌和心血管疾病治療方面擔(dān)當(dāng)了重要的角色。

茶葉中的咖啡因具有較強(qiáng)的中樞興奮作用，在茶多酚的提取制備過(guò)程中作為雜質(zhì)要盡量去除。以往心腦健片的質(zhì)量控制主要以紫外分光光度法檢測(cè)茶多酚及咖啡因的含量[2]，為了有效控制心腦健片的產(chǎn)品質(zhì)量，本文建立了同時(shí)測(cè)定心腦健片中EGCG和咖啡因含量的方法。

1 儀器與試藥

安捷倫Agilent-1100-LC高效液相色譜儀，包括G1311A（四元泵）、G1313A（自動(dòng)進(jìn)樣器）、G1316A（柱溫箱）、VWD檢測(cè)器、Agilent-1100色譜工作站；分析天平（型號(hào)BT125D）。

乙腈為色譜純，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，試驗(yàn)用水為自制純化水。試驗(yàn)用EGCG對(duì)照品、咖啡因?qū)φ掌酚芍袊?guó)食品藥品檢定研究院提供。心腦健片樣品提供單位：花園藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20180301、20180302、20180303；規(guī)格：每片含茶葉提取物0.1g?？瞻纵o料均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱（5μm，200mm×4.6mm），品牌為FeiniGen；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相B，按流動(dòng)相梯度洗脫表（表1）中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。理論板數(shù)按EGCG峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，分離度應(yīng)大于1.5。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取樣品研細(xì)，混勻，取約0.1g，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇適量，超聲處理（功率160W，頻率40kHz）30min，放冷，加25%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取EGCG對(duì)照品約42.5mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含EGCG0.85mg的溶液；稱取咖啡因?qū)φ掌芳s7mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，再精密量取2.0mL置于20mL量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含咖啡因14μg的溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取上述制備的對(duì)照品溶液，用島津UV-2450型紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400nm處掃描，結(jié)果顯示EGCG及咖啡因在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。故以280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，經(jīng)HPLC法測(cè)定，EGCG、咖啡因和樣品中其他組分的色譜峰可達(dá)到基線分離，且與其他相鄰峰分離度大于1.5，理論板數(shù)均在3000以上。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密吸取濃度為0.852mg/mL的EGCG對(duì)照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積積分值，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=916.0777C+10076.8548，r=0.9999。結(jié)果表明：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在1.704～17.04μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

精密吸取濃度為14.2μg/mL的咖啡因?qū)φ掌啡芤?μL、5μL、10μL、15μL、20μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積積分值，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=346.2576C+1462.8342，r=0.9998。結(jié)果表明：咖啡因在14.2～284.0ng范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 空白輔料干擾試驗(yàn)

按心腦健片處方組成，取除茶葉提取物外的輔料，按制備工藝要求制成不含茶葉提取物的陰性對(duì)照樣品。然后，按供試品制備的方法制備陰性對(duì)照溶液，分別吸取陰性對(duì)照溶液與供試品溶液20μL進(jìn)行檢測(cè)。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

結(jié)果表明：陰性對(duì)照品溶液的色譜中，在與EGCG和咖啡因?qū)φ掌飞V峰相應(yīng)位置上無(wú)峰，說(shuō)明空白輔料無(wú)干擾。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液（20180301），重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20μL，分別測(cè)定EGCG和咖啡因峰面積，計(jì)算得到其RSD分別為0.82%和0.50%。

結(jié)果表明：本方法精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按含量測(cè)定方法，對(duì)同一批樣品（20180301）分別制備6份供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20μL注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄EGCG和咖啡因色譜圖與峰面積，EGCG平均含量為39.5mg/片，其RSD為0.58%；咖啡因平均含量為0.8mg/片，其RSD為0.62%。

結(jié)果表明：本方法重現(xiàn)性好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液（20180301）置于室溫下放置，于0h、2h、6h、12h、24h分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄EGCG和咖啡因色譜圖與峰面積，計(jì)算得到其RSD分別為1.02%和0.86%。

結(jié)果表明：樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取心腦健片樣品（20180301）6份，分別精密稱定，再分別加入EGCG和咖啡因?qū)φ掌?，按供試品溶液制備?xiàng)下的方法測(cè)定，記錄色譜圖，考察本方法的加樣回收率。

結(jié)果表明：EGCG平均回收率為98.62%，RSD為1.58%；咖啡因平均回收率為98.75%，RSD為0.85%。

2.11 含量測(cè)定

各批樣品按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液、對(duì)照品溶液，精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，3批樣品的EGCG和咖啡因含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。

根據(jù)《藥典》規(guī)定，心腦健片中EGCG含量應(yīng)≥36.0mg/片，咖啡因含量應(yīng)≤2.0mg/片。從表2可以看出，3批心腦健片樣品中的EGCG和咖啡因含量均符合《藥典》規(guī)定。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）流動(dòng)相及洗脫方法的選擇：參考文獻(xiàn)[3-4]，本試驗(yàn)分別采用了不同系統(tǒng)的流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)：乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）、甲醇-0.1%磷酸溶液（28∶72）進(jìn)行等度洗脫；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相B，按規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫50min。

結(jié)果表明：以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，樣品峰與干擾峰完全分開(kāi)，峰形對(duì)稱，分離效果最佳。

（2）供試品提取時(shí)間的選擇：取樣品內(nèi)容物加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別超聲處理20min、30min、40min，放冷。分別取供試品加入高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：樣品經(jīng)超聲提取30min，EGCG和咖啡因的含量不再增加，因此樣品超聲提取時(shí)間定為30min。

表2 3批樣品EGCG和咖啡因含量測(cè)定結(jié)果

（3）采用HPLC法測(cè)定心腦健片中EGCG和咖啡因的含量，在一定的色譜條件下具有良好的穩(wěn)定性，定量結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，能較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。