內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1對(duì)內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷時(shí)炎癥反應(yīng)的影響

張曉隆，吳海亞，陳潔，吳成云

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.呼吸內(nèi)科）

內(nèi)毒素性急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）是臨床常見(jiàn)急危重癥，病死率高[1]。其主要病理特征是肺組織大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷所致的肺水腫。目前認(rèn)為促炎介質(zhì)的過(guò)度釋放導(dǎo)致的炎癥失控是內(nèi)毒素性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制。在此理論基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的防治策略，主要通過(guò)抑制關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的表達(dá)和效應(yīng)，防止過(guò)度炎癥反應(yīng)[2-3]。雖然有大量研究[4-5]

顯示，從不同角度對(duì)ALI的防治取得了一定成效，但其效果仍然不夠理想。因此，尋找新的有效治療手段，改善內(nèi)毒素性ALI是目前亟待解決的問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外在內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（Endocan）的研究主要局限于其參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管生成等，對(duì)炎癥反應(yīng)時(shí)黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移及特異性免疫應(yīng)答的報(bào)道甚少[6]。本研究采用霧化吸入脂多糖（lipopolysac charides，LPS）建立小鼠內(nèi)毒素性ALI模型，使用外源性Endocan來(lái)干預(yù)小鼠內(nèi)毒素性ALI的變化，觀察其對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只，平均體質(zhì)量（20±2）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0001。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Endocan重組蛋白購(gòu)自美國(guó)CLOUD-CLONE CORP公司，髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）購(gòu)自美國(guó)R&D公司；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購(gòu)自法國(guó)Diaclone公司。

1.2 模型復(fù)制與分組 將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為Control組、LPS組和Endocan組，每組10只。LPS霧化吸入法建立小鼠ALI模型，自動(dòng)霧化吸入裝置啟動(dòng)后，空氣壓縮機(jī)將壓縮后的空氣送到裝有LPS濃度為400 μg/mL的塑料管中，使LPS成為霧狀液體，接入裝有小鼠的密閉容器中，持續(xù)霧化30 min，Control組霧化吸入相同時(shí)間和等量的0.9%氯化鈉溶液。Endocan組于實(shí)驗(yàn)前30 min腹腔注射Endocan 0.25 mg/kg，Control組、LPS組使用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.3 肺組織的檢查 剪取右肺上葉小鼠肺組織稱(chēng)質(zhì)量，然后放入50 ℃烤箱中72 h，再次稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肺濕/干重比（W/D），以評(píng)價(jià)肺組織的水腫程度?；瘜W(xué)比色法測(cè)定肺組織中MPO活性，具體操作嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。取左肺門(mén)旁0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織2～3塊，4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片，Power tome-XL型超薄切片機(jī)切片，日立H-7500型透射電鏡觀察。

1.4 TNF-α、IL-6和ICAM-1的檢測(cè) 造模24 h后，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，開(kāi)胸，結(jié)扎小鼠左主支氣管，取左肺。頸部分離氣管進(jìn)行插管后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）灌洗右肺3次，1 mL/次，回收率大于80%。將回收的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心后分別獲得上清。用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和ICAM-1的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織W/D和MPO含量的變化 LPS組小鼠肺組織W/D較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明存在肺水腫。Endocan組小鼠肺組織W/D較LPS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示Endocan能減輕ALI時(shí)肺的含水量。LPS組小鼠肺組織中的MPO活性較Control組明顯增高（P＜0.01），Endocan組小鼠肺組織中MPO活性較LPS組減低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織W/D和MPO的變化

2.2 肺組織超微結(jié)構(gòu)改變 Control組：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，連接緊密，基底膜完整；I型肺泡上皮細(xì)胞正常；II型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；線粒體嵴清楚，微絨毛無(wú)減少，板層小體數(shù)量未見(jiàn)改變（見(jiàn)圖2A）。LPS組：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，連續(xù)性中斷，基底部變窄，呈拱橋狀或高柱狀向腔內(nèi)突出，部分脫落；I型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡較少；II型肺泡上皮細(xì)胞表面微絨毛稀疏，線粒體腫脹明顯，板層小體稀少空泡化，肺泡隔水腫，肺泡隔及毛細(xì)血管內(nèi)見(jiàn)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞附著（見(jiàn)圖2B）。Endocan組：毛細(xì)血管和肺泡結(jié)構(gòu)有所改善，毛細(xì)血管內(nèi)炎癥細(xì)胞減少，染色質(zhì)分布較均勻；I型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡較多；II型肺泡上皮細(xì)胞表面微絨毛及板層小體增多；肺泡隔輕度水腫（見(jiàn)圖2C）。

2.3 小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1的水平 與Control組比，LPS組TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均明顯升高（P＜0.01），經(jīng)過(guò)Endocan干預(yù)后，Endocan組TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均較LPS組降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平的變化

3 討論

ALI/ARDS是由肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的肺組織病理?yè)p傷、肺泡血管屏障破壞、炎癥反應(yīng)和肺臟生理功能異常。肺是膿毒血癥的易損器官之一，內(nèi)毒素促進(jìn)大量炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，引起肺內(nèi)中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）的聚集和激活，是造成ALI的重要原因。本研究觀察到LPS組小鼠肺組織W/D明顯增高，電鏡下觀察到肺毛細(xì)血管內(nèi)皮、I型肺泡上皮細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞、線粒體和板層小體等肺超微結(jié)構(gòu)損傷改變，肺泡隔及毛細(xì)血管內(nèi)見(jiàn)大量以PMN為主的炎癥細(xì)胞附著；與Control組比，肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血等情況均顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)霧化吸入LPS致小鼠ALI的模型有效可行。

目前炎癥反應(yīng)機(jī)制在內(nèi)毒素性肺損傷中的研究越來(lái)越受到大家的關(guān)注，ALI是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的綜合征，表現(xiàn)為促炎因子的明顯升高，抑炎因子的下降以及凝血纖溶系統(tǒng)失衡為特征。參與這些炎癥反應(yīng)的包括PMN、血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，其中PMN、單核巨噬細(xì)胞等在ALI中發(fā)揮了重要作用。在內(nèi)毒素性肺損傷時(shí)，PMN聚集、活化和釋放炎性介質(zhì)，其關(guān)鍵為PMN通過(guò)ICAM-1與內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致釋放多種細(xì)胞因子，引起免疫應(yīng)答形成網(wǎng)絡(luò)連鎖反應(yīng)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)失衡[7]，內(nèi)皮功能的快速變化激活凝血系統(tǒng)，微血栓形成引發(fā)血液流變學(xué)的變化，導(dǎo)致組織缺血缺氧引起器官衰竭[8]。本研究顯示，霧化吸入LPS后小鼠血清TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1水平均顯著升高，我們推測(cè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，分泌大量黏附分子和趨化因子等，從而促進(jìn)PMN、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位聚集，在內(nèi)毒素性肺損傷中發(fā)揮重要作用，與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致。

Endocan又稱(chēng)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1，在正常人體內(nèi)主要由肺、腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌[10]。Endocan是淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）的一個(gè)特異性配體，它可以與LFA-1結(jié)合，通過(guò)對(duì)LFA-1與ICAM-1競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，阻止PMN在內(nèi)皮細(xì)胞黏附[11]，Endocan具有非常廣泛的生物學(xué)活性，可能通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與體內(nèi)黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)、血管生成、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過(guò)程[12-13]。過(guò)去大量研究表明，Endocan與人類(lèi)多種惡性腫瘤密切相關(guān)[14-16]，新近有研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS早期Endocan水平升高反映病情的嚴(yán)重程度，并預(yù)測(cè)不良的演化，如死亡或?qū)C(jī)械通氣的長(zhǎng)期依賴(lài)，提示Endocan可能成為預(yù)測(cè)其發(fā)生率和病死率的重要指標(biāo)[17-19]。MIKKELSEN等[20]報(bào)道了嚴(yán)重創(chuàng)傷后ALI患者血清Endocan沒(méi)有升高，而是處在低水平狀態(tài)，推斷Endocan的分泌不足導(dǎo)致肺組織過(guò)度炎癥反應(yīng)使肺損傷加重。本研究采用外源性Endocan來(lái)干預(yù)小鼠內(nèi)毒素性肺損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LPS組比，Endocan組小鼠肺組織W/D和MPO活性降低（P＜0.01），BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均降低（P＜0.01），肺組織超微結(jié)構(gòu)改變顯著減輕。由此，我們認(rèn)為Endocan能夠降低LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI時(shí)MPO活性和ICAM-1的水平，推斷Endocan可能通過(guò)調(diào)控PMN從血液到組織的遷移及特異性免疫應(yīng)答過(guò)程，抑制LFA-1/ICAM-1的相互結(jié)合，從而阻止PMN通過(guò)血管壁隨意遷移，減少PMN向炎癥部位聚集，減輕肺組織損傷，從而在內(nèi)毒素性肺損傷中起器官保護(hù)作用。

綜上所述，Endocan可減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，提示Endocan在ALI時(shí)具有保護(hù)作用。值得注意的是，Endocan的分泌不足或過(guò)度分泌均可導(dǎo)致組織器官的損傷，而Endocan分泌可能是炎癥反應(yīng)過(guò)程中機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其過(guò)度分泌可導(dǎo)致機(jī)體免疫保護(hù)作用受到限制，繼而加重ALI，故Endocan在ALI中的作用機(jī)制有待于在以后的研究中進(jìn)一步探索。