外源cGMP調控鹽脅迫下黑麥草種子萌發機制

宿梅飛,魏小紅,辛夏青,岳 凱,趙 穎,韓 廳,馬文靜,駱巧娟

甘肅農業大學生命科學技術學院,蘭州 730070

環鳥甘酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)是一種具有細胞內信息傳遞作用的第二信使(second messenger),可被G蛋白偶聯受體(G-protein linked receptor)激活的蛋白激酶(protein kinases)所活化[1],進而將胞外信號轉至細胞核,是一種具有廣泛生物學活性的環核苷酸。cGMP在生物、非生物脅迫及激素響應等眾多的植物生理過程中起著非常重要的調節作用[2],其信號通路以及它的反饋調節是通過cGMP合成和降解的相互作用來控制,其合成和降解分別是由鳥苷酸環化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)完成的[3]。GC能催化GTP形成cGMP,使其發揮生物學功能,而PDE能使cGMP變成5′GMP而失活。因此,植物能準確調控體內的cGMP含量,進而參與各種生理過程[4]。目前關于cGMP在植物信號轉導中的作用正在逐漸被揭示[2]。研究發現,在一些植物材料中每克新鮮樣品中含有1—10 pmolcGMP[5]。通過施加外源cGMP的膜透性類似物8-Br-cGMP能增強擬南芥(Arabidopsisthaliana)對鹽脅迫的耐受性[6]。此外,還發現在辣椒(Capsicumannuum)中,cGMP可以調節Na+和K+的流量來維持離子平衡[7]。當植物受到非生物脅迫,例如滲透脅迫或鹽脅迫時植物中的cGMP含量會上升5—10倍[8]。說明cGMP能增強植物對脅迫的耐受性,并作為一種信號物質在植物的脅迫響應中發揮著重要調控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年5月—9月在生命科學技術學院植物生理實驗室進行,供試材料為多年生黑麥草種子,購于甘肅農業科學院種子公司,千粒重為2.0034 g,室溫避光保存、8-Br-cGMP購買于ApexBio公司。

1.2 試驗方法

選取籽粒飽滿,大小一致,無病蟲害黑麥草種子,用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒5 min,再用蒸餾水沖洗5—6次。將消毒后的黑麥草種子隨機播在鋪有兩層濾紙的培養皿(φ=9 cm),每皿放置50粒,用不同濃度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)的NaCl培養液和含有20 μmol/LcGMP的不同濃度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)的NaCl溶液培養。所有的培養皿放入在(25±1)℃、相對濕度為80%、12 h光照/12 h黑暗的條件下的恒溫光照培養箱中培養,光照強度4000 Lux,每24 h更換一次處理液4 mL。以胚根露出作為種子萌發的標志,每24 h記錄一次,一直測定至第7天,測定其發芽指標,每組處理設置了3個重復。

另外試驗設計了3個處理：(1)CK(蒸餾水);(2)100 mmol/L NaCl溶液:(3)20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl 。分別用蒸餾水、100 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl浸泡黑麥草種子48 h,將種子置于墊有雙層濾紙的培養皿(φ=9 cm)中,每皿50粒種子,每個處理重復3次,每個培養皿加處理液4 mL,24 h更換一次處理液。培養在(25 ± 1)℃,12 h光照/12 h黑暗條件下,分別在處理后的0、2、4、6 d取樣,用于萌發期主要物質的測定；再取2、4、6、8 d測定其幼苗的生理指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 種子發芽指標

發芽率(germination percentage,GP)=7 d內發育種子數/測試種子數×100%[17]

發芽勢(germination energy,GE)=前4 d發芽種子數/測試種子總數×100%[18]

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)[19](式中,Dt為發芽日數,Gt為與Dt相應的每天的發芽種子數)

活力指數(VI)=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[20]。(式中,幼苗鮮重為稱取5株幼苗的重量)

植株全長、根長、葉長用游標卡尺測量(長度為總共50株植株的平均值)。

1.3.2 生理指標的測定

1.4 數據統計分析

每組數據設定3個重復,采用Microsoft Excel 2010整理分析數據,使用SPSS19.0 (Duncan法)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 外源cGMP對不同濃度鹽脅迫下黑麥草種子萌發的影響

由表1知：與CK相比,隨著NaCl濃度的升高,黑麥草的發芽率(G)呈現先升高后降低的變化趨勢,不同處理差異顯著(P<0.05)；發芽勢(GE)、發芽指數(GI)和活力指數(VI)均呈現逐漸降低的變化趨勢,不同處理差異顯著(P<0.05)。其中,50 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子比對照組芽率提高了3.5%；而100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子的發芽率(G)、發芽勢(GE)、發芽指數(GI)和活力指數(VI)分別比對照降低了38.9%、73.5%、141.8%和141.0%；而當NaCl的濃度達到250 mmol/L時,黑麥草種子的發芽率(GP)、發芽勢(GE)、發芽指數(GI)和活力指數(VI)均達到最低,黑麥草種子基本喪失活性。在不同濃度(50、100、150、200、250 mmol/L)NaCl脅迫下,加入20 μmol/LcGMP皆能提高黑麥草種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數。其中對100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子萌發最為顯著。20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子比單獨100 mmol/L NaCl處理的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別提高了7.4%、133.3%、52.1%和104.2%。

2.2 外源cGMP對鹽脅迫下黑麥草種子萌發生長狀況的影響

由圖1可知：從植物的生長形態上明顯看出,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子在萌發過程中,比單獨100 mmol/L NaCl脅迫的黑麥草種子萌發時有明顯的促進生長的作用。由表2可以得到：20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl 處理的比單獨100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子的全長、根長及葉長都有顯著的提高,分別提高了2.5、2.8倍和2.6倍。

2.3 外源cGMP對鹽脅迫下種子萌發過程中主要物質變化的影響

在不同的處理條件下,隨著處理時間的延長,黑麥草種子內可溶性蛋白含量均呈現逐漸上升的趨勢(圖2)。在處理的第2天,100 mmol/L NaCl和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子內可溶性蛋白含量顯著高于對照組,且20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子內可溶性蛋白比100 mmol/L NaCl處理下的可溶性蛋白含量升高15.7%,比對照提高了56.1%；在處理的第4天,三組處理可溶性蛋白含量變化不明顯；在處理的第6天,各處理之間差異顯著(P<0.05),其中加入第二信使cGMP處理的黑麥草種子內可溶性蛋白含量比對照增加了21.3%,比單獨100 mmol/L NaCl脅迫下升高了8.4%。

表1 不同濃度NaCl對黑麥草種子萌發的影響

同列數值不同小寫字母表示差異達5%顯著水平

表2 外源cGMP對100 mmol/L NaCl脅迫下黑麥草種子生長狀況的影響

圖1 外源cGMP對100 mmol/L NaCl脅迫下黑麥草種子生長狀況的影響Fig.1 Effects of exogenous cGMP on seed germination of growth condition under 100 mmol/L NaCl stress

在不同的處理條件下,黑麥草種子內可溶性糖含量均隨著處理時間的延長整體呈現升高的趨勢(圖2)。在處理的第2天對照組可溶性糖含量比第0天提高了59.1%,而加入外源cGMP和單獨NaCl脅迫下可溶性糖含量變化不明顯；在處理的第4天,100 mmol/L NaCl和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子內可溶性糖含量達到最大值,其中加入外源cGMP處理的比100 mmol/L NaCl單獨處理和對照分別增加了10.7%和33.3%；在處理的第6天,100 mmol/L NaCl單獨處理的黑麥草種子內可溶性糖含量突然下降,而加入外源cGMP處理和對照略微升高,變化幅度不明顯,加入外源cGMP處理的比對照和100 mmol/L NaCl單獨處理的增加了34.3%和47.9%。

圖2 外源cGMP對NaCl脅迫下黑麥草種子萌發過程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of exogenous cGMP on the soluble protein and sugar content in germinating ryegrass seeds under NaCl stress相同處理天數不同字母表示差異顯著(P<0.05)

由圖3可知：各處理下的黑麥草種子內淀粉含量均隨著處理時間的延長,整體呈現先升高后下降的變化趨勢。在處理的第2天,3個處理淀粉含量均達到最大值,分別增加了30.8%、28.6%、9.9%；在處理第4天,各處理之間差異顯著(P<0.05),各處理下黑麥草種子內淀粉含量迅速下降；在處理的第6天,不同處理下種子內淀粉含量下降并達到最低點,各處理間差異顯著(P<0.05)；其中,加入外源cGMP處理比單獨100 mmol/L NaCl處理和對照分別下降了11.3%和50.4%。

由圖3可知：各處理下的黑麥草種子內淀粉酶活性均隨著處理時間的延長,整體呈現先升高后降低的變化趨勢。在處理的第2天,3個處理之間差異顯著(P<0.05),其中對照分別比加入外源20 μmol/LcGMP和100 mmol/L NaCl單獨處理的淀粉酶活性增加15.3%、24.3%；在處理第4天,3個處理都達到最大值,其中對照組和施加cGMP處理的淀粉酶活性差異不顯著,兩者比單獨100 mmol/L NaCl處理下的分別提高了46.8%和48.6%；在處理的第6天,對照組淀粉酶活性最高,分別比100 mmol/L NaCl和施加cGMP處理下的高69.0%、29.4%,20 μmol/LcGMP與100 mmol/L NaCl共同處理下的比100 mmol/L NaCl單獨處理的淀粉酶活性提高了53.2%。說明cGMP促進黑麥草種子內淀粉酶活性,加速了淀粉的水解,為種子萌發提供能量。

圖3 外源cGMP對NaCl脅迫下黑麥草種子萌發過程中淀粉和淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous cGMP on the starch contentand amylase activity in germinating ryegrass seeds under NaCl stress

2.4 外源cGMP對鹽脅迫下黑麥草種子萌發過程中生理指標的影響

從圖4可以看出：CK與100 mmol/L NaCl處理下的黑麥草種子在萌發過程中的MDA含量都呈現上升的趨勢,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl呈現先上升后下降的趨勢,在處理的第6天達到最大值。在處理的第2天,3個處理之間存在顯著性差異(P<0.05)；處理的第4天,100 mmol/L NaCl單獨處理的比CK與加入外源cGMP處理的分別增加了3.0倍和1.6倍,3個處理之間存在顯著的差異性(P<0.05)；在處理的第6天,100 mmol/L NaCl單獨處理比CK與加入外源cGMP處理的分別增加了2.3倍和1.4倍,加入外源cGMP的黑麥草種子內MDA含量達到最大值；在處理的第8天,CK與加入外源cGMP的黑麥草種子萌發過程中MDA含量無明顯差異,100 mmol/L NaCl單獨處理比CK和加入cGMP處理增加了1.8倍和1.6倍。

由圖4可知：隨著發芽時間的延長,黑麥草種子萌發過程中脯氨酸含量先上升后下降。鹽脅迫增加了黑麥草種子萌發過程中脯氨酸含量,并在第6天達到最大值,而后緩慢下降,在處理的整個過程中始終高于CK；與100 mmol/L NaCl單獨處理相比,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理明顯增加了黑麥草種子在萌發過程中脯氨酸含量,在處理的2—8 d,分別提高了1.5、1.5、1.7倍和2.2倍。

圖4 外源cGMP對NaCl脅迫下黑麥草種子萌發過程中MDA和脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of exogenous cGMP on the MDA content and proline contentin germinating ryegrass seeds under NaCl stress

相對電導率可反映細胞膜受損傷的程度,如圖5所示,100 mmol/L NaCl處理明顯增加了黑麥草的相對電導率,并且相對電導率隨著處理時間的延長而顯著增加,而CK變化不明顯。20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理黑麥草種子,其相對電導率小于100 mmol/L NaCl單獨處理,在處理的第6天和第8天,100 mmol/L NaCl處理的黑麥草的電導率分別比CK和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理增加了1.7、1.4、1.9倍和1.3倍。

由圖5可以看出：隨著發芽時間的延長,黑麥草種子在萌發過程中H2O2含量呈現先上升后下降趨勢,其中在第6天達到最大值,整個處理過程中,各處理之間差異顯著(P<0.05)。鹽脅迫明顯增加黑麥草種子萌發過程中H2O2的積累,而加入外源cGMP能顯著降低鹽脅迫下H2O2含量的積累,但都比CK積累的H2O2含量高,其中在處理的第6天,100 mmol/L NaCl單獨處理的黑麥草種子內H2O2的積累量分別比CK和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl增加了2.7倍和1.4倍。

圖5 外源cGMP對NaCl脅迫下黑麥草種子萌發過程中、相對電導率和H2O2含量的影響Fig.5 Effect of exogenous cGMP on the production rate、electrolyte leakage and H2O2 content in germinating ryegrass seeds under NaCl stress

3 討論

3.1 不同濃度鹽脅迫下黑麥草種子萌發

在植物生長的整個生育期中,種子萌發期和幼苗生長期是最重要的兩個階段,其中種子萌發期是鹽脅迫響應比較敏感的階段,決定著作物的生長及產量[25]。鹽脅迫影響植物細胞的正常生長代謝過程,導致種子發芽率、發芽勢和發芽指數的降低[26]。種子萌發率、萌發勢和活力指數均可以反映種子發芽能力。一般情況下,發芽率與種子生活力是一致的[27]。有研究表明,cGMP處理提高了擬南芥的抗鹽性,表現在鹽脅迫下促進擬南芥的生長和種子的萌發[28]。本試驗發現NaCl脅迫對黑麥草種子的作用表現為低濃度促進,高濃度抑制。50 mmol/L的NaCl處理對黑麥草種子萌發有促進作用,而當NaCl濃度高于50 mmol/L時隨處理濃度的升高黑麥草種子萌發率降、發芽勢、發芽指數和活力指數均呈下降趨勢,且對幼苗和幼根生長的抑制作用加強,這同吳海濤等[29]研究結果一致。低濃度的鹽溶液對種子萌發具有促進或影響很小,高濃度鹽會對種子造成毒害而抑制其萌發,攀瑞萍等[30]認為植物在低鹽濃度的生長環境能滿足幼苗對水分的需求,所以不會造成鹽害,并且鹽中無機離子作為滲透調節物質在一定程度上還可以促進根系生長。當NaCl濃度達到250 mmol/L時,黑麥草種子的萌發率為2.5%,種子活力基本喪失。

植物根系形態變化是生理生化變化的外在表象,而形態發生變化也必然引起內在生理生化指標的變化,二者的變化是相輔相成共同作用抵抗逆境。8-Br-cGMP是cGMP的一種膜透性類似物,cGMP作為細胞內的一種第二信使,能調節植物對生物或非生物脅迫的適應性。已有報道指出,黃瓜中cGMP在生長素誘導的側根生長中起到了重要作用[3]、在綠豆中,cGMP作為H2O2的下游信號促進綠豆不定根的生長[31]。本試驗結果表明,20 μmol/LcGMP對100 mmol/L NaCl脅迫下黑麥草種子的發芽率提升作用不明顯,但能明顯提高黑麥草種子在100 mmol/L NaCl脅迫下的發芽勢、發芽指數和活力指數。本試驗最重要的發現是外源cGMP能促進鹽脅迫下黑麥草種子萌發時根系的生長,同時也能夠促進植株的生長。說明cGMP可能是通過促進鹽脅迫下的種子根系發育,以此緩解鹽脅迫對黑麥草種子萌發時的傷害。

3.2 外源cGMP對鹽脅迫下黑麥草種子萌發時物質代謝的影響

種子萌發過程中需要物質和能量來維持其旺盛的生命活動[32]。種子在萌發期間所需要的養料和能量主要來自貯藏物質的轉化和利用[33]。種子內主要的貯藏物質為淀粉、脂肪和蛋白質。這些物質在種子萌發過程中水解為簡單的營養物質,并運轉到生長部位作為構成新組織的成分和產生能量的原料[34]。有研究顯示cGMP對花青素和類黃酮合成是必需的[35],cGMP能夠調節甘薯葉片中傷害響應因子miR828的表達[36]。說明cGMP參與調節植物的防御響應。本試驗結果表明；鹽脅迫顯著降低了淀粉酶活性,抑制了淀粉的水解,抑制了可溶性糖和可溶性蛋白的增加。加入cGMP能降低種子內淀粉含量,提高淀粉酶活性,增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量。說明,外源cGMP增強了鹽脅迫下種子內淀粉酶活性,促進了淀粉水解,淀粉作為種子內的一種暫時的貯藏物質,不斷水解為可溶性糖以滿足種子萌發生長所需要的營養物質。

3.3 外源cGMP調控鹽脅迫下黑麥草種子萌發時脯氨酸、MDA、電導率、、H2O2含量的影響

滲透調節是植物適應鹽害環境的一種重要生理機制,脯氨酸在植物滲透調節中起著重要作用,可以清除活性氧,提高抗氧化能力,穩定生物大分子結構,降低細胞酸性,解除氨毒[37]等。本試驗研究發現,加入外源cGMP能顯著提高鹽脅迫下黑麥草種子萌發時的脯氨酸含量,且在處理的不同時間,外源cGMP處理的黑麥草種子內脯氨酸含量都明顯高于CK與100 mmol/L NaCl單獨處理,這有利于緩解鹽害對植物造成的傷害。

植物在受到鹽害脅迫時,細胞內活性氧代謝平衡會被破壞從而產生活性氧,造成細胞膜系統的損害,引發或加劇膜脂過氧化的作用,最終產物主要為MDA,并導致植物外滲物質增加,電導率增加。本試驗研究發現100 mmol/L NaCl處理黑麥草種子萌發過程中,MDA含量和電導率都明顯高于CK；而20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl處理的黑麥草種子萌發時MDA含量和電導率顯著低于100 mmol/L NaCl單獨處理,但都比CK高,說明cGMP通過控制MDA及外滲物質的含量來保護鹽脅迫下植物的生長。

4 結論