基于Y形光纖的便攜式免疫熒光定量檢測系統*

蘇廣，胡志剛,2△，杜喆，祖向陽

(1.河南科技大學醫學技術與工程學院，河南 洛陽 471003； 2.河南省機器人與智能系統重點實驗室，河南 洛陽 471003)

1 引 言

當今大型自動化分析儀與流水線的模塊組合和小型儀器簡單操作的POCT(point-of-care testing,POCT)是檢驗醫學的兩大發展方向，隨著臨床檢測“去中心化”的發展趨勢，POCT以其儀器和試劑體積小、便攜、操作簡單且能快速獲得結果等特點，正廣泛應用于醫院及院外患者管理。

熒光免疫層析技術是熒光標記技術與免疫層析技術創新性結合發展起來的一種新型POCT定量檢測技術，與以膠體金免疫層析為代表的傳統POCT定性檢測技術相比，不僅保留了操作簡便、檢測快速、便攜性強的優點，同時通過熒光示蹤增強技術實現了檢測結果的精確定量。該技術靈敏度高、特異性強，是目前POCT檢測技術的主要研究方向[1]，與該技術配套的熒光定量檢測儀器也越發受到重視[2]。在熒光定量檢測儀的設計中，激光誘導熒光檢測的光學設計方案是其中的核心部件，目前常見的設計方案有共聚焦式光學結構檢測法[3]、光纖式光學結構檢測法[4]、圖像處理檢測法[5]等，其中共聚焦式光學結構組裝復雜，體積大，不利于儀器的小型化；基于圖像處理法的免疫熒光檢測系統成本高昂，且功耗較高。因此，本研究采用光纖式光學結構，以激光二極管作為激發光源，Y形光纖進行激光傳導及熒光收集，硅光電二極管作為熒光檢測傳感器，光路結構簡單，設備體積小；設計Sallen-Key拓撲結構三級二階具有巴特沃斯響應的有源低通濾波器對微弱信號進行濾波放大處理；另外，本研究采用STM32F103ZET6微處理器、ADS1255模數轉換器、TB62209步進電機驅動芯片設計了核心電路，實現對免疫熒光信號的掃描檢測。

2 Y形光纖結構及檢測原理

Y形光纖成分為摻高羥基離子石英，在250～1 200 nm波長范圍內，光波傳播基本不受影響，無能量衰減。Y形光纖的結構及檢測原理示意圖見圖1，兩端分別為分叉端和探頭端。分叉端一端與激光二極管相連作為光源，由直徑600 μm的單一光纖構成，另一端與光電二極管連接，構成熒光-電信號轉換裝置，由12根200 μm的細光纖組成；二者相交后以600 μm的大光纖為中心，12根200 μm的小光纖圍繞大光纖按衛星式排布形成探頭端，探頭直徑為6.35 mm。

相對于鏡片式光學結構組裝的復雜性，Y形光纖式結構只需簡單的控制探頭到待檢測樣品的距離。距離的大小與光纖的數值孔徑有關，多模光纖的數值孔徑是一個無量綱的數，能夠描述光纖端面接收光的能力，即接收光的角度范圍。數值孔徑大小NA由式(1)決定：

圖1 Y形光纖結構圖

(1)

其中n為樣品與光纖端面之間介質的折射率，θ為接收角的一半，只有入射角度小于θ的光線才能發生全反射被傳輸，數值孔徑的大小取值一般要兼顧光接收能力和對模式色散的影響。本系統不需要考慮到光線傳輸的時延差，為了獲得更高的耦合效率，選擇數值孔徑為0.37的多模光纖，光線束的數值孔徑與所構成的單根光纖的數值孔徑相同，因此，光纖束探頭端的數值孔徑為0.37，接收角度范圍為22°，通過實際樣本區的大小即可計算出探頭到樣本的距離。

3 系統硬件設計

3.1 整體方案設計

系統總體框圖見圖2，由微處理器核心模塊、光路結構模塊、熒光信號采集及濾波放大模塊、模數轉換模塊、步進電機驅動模塊、激光驅動模塊、熱敏打印機模塊等構成。STM32F103ZET6微處理器通過脈沖信號方式控制步進電機驅動模塊，步進電機帶動試紙條傳動機構將試紙條遞送到光纖探頭所處位置；試紙條上被激發的微弱熒光信號經過Y形光纖收集后照射到光電二極管的光接收窗口，使得光電二極管產生微弱的電流信號，電流信號經過電流/電壓轉換以及放大濾波處理，由模數轉換電路處理成數字信號送至STM32F103ZET6微處理器進行處理。微處理器再通過熱敏打印機或者電容式觸摸屏輸出熒光信號采集結果。

3.2 單元電路設計

3.2.1激光二極管驅動電路 Y形光纖的光源端與激光二極管相連將激發光傳輸到探頭端對樣本進行熒光激發，為了避免激發光光強的波動給熒光信號的采集帶來干擾，需要輸出穩定的電流來驅動激光二極管。在本設計中，采用穩壓源加三極管的方式構建恒流源電路，通過控制發射極電流恒定使集電極輸出穩定的激光二極管驅動電流(見圖3)。在實際應用中，選用波長488 nm，最大輸出功率60 mw的激光二極管，其工作電流為50 mA，通過調節穩壓源電壓和三極管發射極電阻的比值來控制輸出電流的大小。

圖2 系統總體框圖

圖3 恒流源驅動電路原理圖

Fig3Digramaofexcitationsourcedrivedbyconstant-currentsource

3.2.2熒光信號采集及濾波放大電路 Y形光纖的檢測端通過濾光片和聚焦透鏡將熒光傳輸到光電二極管的光接收窗口。光電二極管在光伏模式下能夠將熒光信號轉換成微弱的電流信號，然而采集到的微弱電流信號通常會混雜噪聲，在對硅光電二極管光電檢測電路噪聲特性的研究基礎上[6]，本研究設計了光電二極管的前級I/V轉換電路和濾波放大電路。圖4為I/V轉換電路，通過調節反饋電阻的大小控制輸出電壓，在運放同相端加入匹配電阻和匹配電容，減小輸入偏置電流、輸入失調電壓和溫漂的影響。其輸出電壓和輸出信號帶寬分別為：

VP=IP×R2

(2)

(3)

為了提高整個系統的信噪比，需要對采集到的電流信號進行濾波放大處理，本部分電路采用Sallen-Key拓撲結構設計三級二階有源低通濾波電路，并提供巴特沃斯響應，在通帶范圍內無紋波，截止頻率處具有良好的衰減效果[7]。

圖4 前級I/V轉換電路原理圖

Fig4Schematicdiagramofconversioncircuit

圖5為濾波放大電路原理圖，其各級電路參數的計算類似第一級參數的計算方法，如下：

C4=mC3

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，m為電容擴展系數，Q為品質因數(第一級0.5176、第二級0.7071、第三級1.9319)，K為放大倍數，ωc為截止頻率。

圖5 三級二階有源低通濾波放大電路原理圖

Fig5Schematicdiagramoflowpassfilteramplifier

3.2.3模數轉換電路 在微弱熒光信號采集系統中，可能需要對多路不同波長的熒光信號進行采樣，為了方便系統擴展而又不造成資源浪費，本系統選用ADS1255集成24位Δ-Σ型ADC構成單極性雙通道模數轉換電路(見圖6)，大大簡化了信號調理電路，減小了電路板面積、減少了器件數量和生產成本。此電路使用外部精準基準電壓源ADR4525產生AD芯片的基準電壓，具有高精度、低漂移、低噪聲、低靜態電流等特性。這些特性使得ADR4525非常適合便攜式設備的高精度轉換應用，它與ADS1255相結合，能夠實現具有相當好的集成度和精度的低功耗微弱熒光信號模數轉換電路。

圖6 模數轉換電路原理圖

3.2.4步進電機驅動電路 試紙條傳動機構運行的穩定性和定位的精確性對檢測結果有著至關重要的影響。該系統采用東芝公司的步進電機驅動芯片TB62209設計步進電機驅動電路，具有最高16細分、峰值電流1.8 A、自動半流鎖定和步進脈沖驅動等特性。另外還有兩路槽型光耦限位電路，作為試紙條傳動機構的零位信號和限位信號，槽型光耦設計為常閉狀態，當運動超過限定位置或故障時發送報警信號。電路原理圖見圖7。

圖7 步進電機驅動電路原理圖

4 軟件設計

軟件底層驅動部分主要有LCD驅動模塊、微型打印機驅動模塊、串口驅動模塊、AD采樣驅動模塊、步進電機驅動模塊、激光二極管驅動模塊。實時操作系統采用μCOS-III內核，它是一個實時多任務內核，具有易移植、可擴展、可固化、快速響應中斷等優點，適合應用到熒光檢測平臺。軟件代碼的編寫使用C語言、調試仿真都基于Keil集成開發環境，結合ST公司的固件庫、StemWin圖形用戶接口庫、μCOS內核、FatFs文件系統實現系統硬件設備的控制和熒光信號的掃描檢測。系統的總流程圖見圖8。

圖8 系統軟件流程圖

5 系統測試結果與分析

5.1 AD精度測試

為了測試AD采樣精度，使用3個不同的參考點電壓作為AD的模擬輸入信號，對系統的模數轉換性能進行評估。分別對3個參考電壓點連續采集200個數據，測試結果見表1。在較穩定的地參考點和基準電壓參考點具有很小的采樣偏差和標準差，該系統的模數轉換模塊具備很好的精度和重復性。

表1 AD采樣實驗

5.2 熒光微球實測實驗

為了測試本系統的靈敏度，采用蘇州為度生物技術有限公司生產的300 nm綠色熒光微球，其激發波長和發射波長分別為488 nm和520 nm，分別對其稀釋8、16、32、64、128、256倍，對不同濃度梯度的微球熒光進行掃描檢測，得到的各個梯度濃度的熒光信號轉換電壓值曲線見圖9。

圖9 微球熒光稀釋濃度與電壓值曲線圖

Fig9Thecurveoffluorescencedilutingfactorandmagnitudeofvoltage

將上述掃描檢測數據取波峰值與稀釋倍數擬合曲線(見圖10)，其乘冪趨勢良好，相關系數為0.9971，說明該熒光檢測系統靈敏度高，即使在稀釋倍數足夠大的情況下，仍然能夠獲取有效信號值。

圖10 光電轉換信號與稀釋倍數的線性關系

Fig10Thecorrelationbetweenphotoelectricconversionsignalanddilutingfactor

6 結束語

Y形光纖式免疫熒光定量檢測系統經過平臺搭建調試，實測表明能夠很好完成免疫熒光信號的定量檢測。該系統使用Y形光纖作為光信號的傳輸介質，光電二極管將熒光信號轉換成電壓信號，在經過有源濾波和放大之后，通過模數轉換模塊能夠穩定精確地轉換成數字信號，試紙條傳動機構具有高效穩定、低噪聲、精準定位的工作表現，整個裝置占用空間小，功耗低，安裝結構簡單，儀器成本低，檢測結果靈敏度高，重復性好。