LHX6基因在肝癌轉移中的作用機制及臨床預后意義

袁堂戰，蔣珂，程海濤，朱湘南

（1.南昌大學第四附屬醫院普外科，江西 南昌 330003；2.南昌大學第四附屬醫院消化內科，江西 南昌 330003）

人類LHX6（LIM homeobox domain 6）基因定位在9號染色體的q33.2位置，是編碼LIM同源域的一類轉錄因子[1]。已有研究表明，LHX6參與了胚胎發育過程和多器官系統的形態發生，包括頭部發育、顱頜面發育和生殖細胞分化等過程，尤其在皮層和海馬中的神經元遷移和分化中具有重要功能[2-3]。近些年來，有研究認為LHX6基因甲基化可以作為一個識別頭頸癌的甲基化標記物，而在乳腺癌、宮頸癌、結腸癌等多種癌癥中則可能具有重要的早期診斷價值[4-5]。最近的研究顯示，LHX6在肺癌中是一個潛在的受DNA甲基化調控的典型抑癌基因[6]。

肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率的第6位，死因的第3位[7]。在我國，肝癌（HCC）僅次于肺癌，是位列第2位的惡性腫瘤殺手，占我國全部惡性腫瘤死亡人數的18.8%。截至目前，已確定了以手術治療為核心的肝癌綜合治療方案[8]，但目前肝癌的總體治療效果仍難令人滿意，術后5年復發率高達60%（小肝癌也達40%～50%）[9]。因此，我們有必要探尋新的肝癌分子生物學標記物，為肝癌的靶向治療提供有效的藥物靶點。

LHX6基因在肝癌中的具體抑癌分子機制以及在臨床預后中的意義目前還不清楚。前期實驗中，我們通過對54例肝癌組織標本檢驗，發現LHX6在肝癌組織中呈顯著低表達，并且其表達水平與肝癌臨床病理因素相關，包括病理分級、腫瘤大小等。本次研究，我們收集80例肝癌組織標本，通過免疫組織化學染色觀察肝癌侵襲指標的表達狀況，同時，通過體外和體內的肝癌細胞培養，探索LHX6基因在肝癌轉移中的表達、作用、機制及可能的臨床預后意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人肝癌細胞株HepG2由本實驗室保存；pcDNA3.1（+）/LHX6重組質粒、siRNA-LHX6由本實驗室構建；MTT試劑盒、反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（美國Bio-Rad Laboratories公司）；DMEM培養基、Opti-MEM、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗、PBS（美國Gibco公司）；E-cadherin多克隆抗體、Vimentin多克隆抗體、Snail多克隆抗體（英國Abcam公司）、熒光染料標記的680驢抗兔第二抗體、熒光染料標記的780羊抗鼠第二抗體、熒光素標記兔抗鼠第二抗體（美國LI-COR公司）；免疫組織化學試劑盒、二胺基聯苯胺（DAB）顯色盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），ABC試劑盒（美國Vector Lab）。

1.1.2 實驗動物 BALB/C裸小鼠購自南昌大學動物實驗中心，鼠齡6周，體質量18～25 g，于室溫22～26℃，相對濕度40%～60%的SPF級動物實驗室飼養，墊料、水及飼料均經高壓滅菌處理，每3天更換一次，籠具浸泡在1∶1 000的新潔爾滅中消毒。

1.1.3 臨床標本 80例臨床肝癌標本收集來自于南昌大學第四附屬醫院，標本收集取得患者同意，所有標本均經病理學檢查證實。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色觀察侵襲指標的表達狀況

（1）LHX6基因免疫組化染色：將臨床肝癌標本，經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制成5 μm厚的連續切片。常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，經甲醇配置的1%H2O2和3%胎牛血清處理；加入LHX6 37℃孵育1 h，置4℃環境下過夜，PBS洗滌；滴加生物素標記第二抗體37℃孵育1 h，PBS洗滌；加ABC 37 ℃ 1 h；DAB顯色，脫水、透明、干燥、封片。

（2）侵襲指標免疫組化染色：將臨床肝癌標本，經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制成5 μm厚的連續切片。ECadherin、Vimentin、Snail抗體工作液濃度分別為1∶50、1∶100、1∶50。免疫組織化學SP法進行染色，具體步驟：放置組織切片于烤箱，68℃20 min；常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液高溫抗原熱修復15 min，冷卻至室溫，3%H2O237℃孵育20min，正常羊血清工作液封閉30 min；依次滴加第一抗體4℃過夜，滴加生物素標記第二抗體37℃孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、干燥、封片。

1.2.2 體外肝癌細胞培養

（1）細胞培養：人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2平衡濕度培養箱中培養，每隔3天換1次液。當觀察到細胞生長處于對數期時（細胞生長鋪滿度約為80%時），然后向培養基內加入用0.25%的胰蛋白酶消化約3 min后，使用倒置顯微鏡對消化細胞形態進行觀察，若發現細胞回縮、細胞間期變大，停止消化。制成細胞懸液后進行傳代培養，當細胞鋪滿器皿的底面后方可應用。

（2）LHX6：質粒轉染及siRNA轉染從NCBI數據庫中調取LHX6全基因序列，GI號：55958142。根據LHX6基因序列設計引物，見表1。

表1 LHX6基因引物名稱Table 1 LHX6 gene primer name

將所需要的轉染試劑和質粒或siRNA按照固定比例加入無血清培養液中，輕敲拍打混勻，室溫避光孵育20 min。將轉染混合物均勻逐滴加入細胞培養板中孵育。在培養箱中進行培養約6 h，然后再用含有10%的小牛血清完全培養基進行培養。

（3）RT-PCR法：按美國Bio-Rad Laboratories公司的實時定量PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA，微量核酸分析儀測定RNA濃度和純度；DEPC水將RNA濃度稀釋成1μg/μl，取2 μl行反轉錄合成cDNA；按試劑盒進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃4 min進行預變性，95℃20 s進行變性，65℃20 s進行退火，75℃15 s進行延伸，共進行40個循環擴增。以GAPDH作為內參。用2-ΔΔCt法計算LHX6基因的相對表達量。

（4）MTT法檢測細胞增殖：收集感染后24 h的細胞，將細胞重懸，以每孔5×103個接種于96孔板，每孔200 L，并設置5個復孔。繼續培養細胞0、24、48及72 h，采用MTT法檢測細胞生長活性（以490 nm波長處的吸光度值表示），待測孔加入20 L MTT，4 h后棄去舊培養基，每孔加入150 L DMSO后水平搖床上輕搖10 min使結晶充分溶解，在酶標儀上于490 nm波長處測定吸光度值，以MTT比色值為縱坐標，時間為橫坐標繪制出各組細胞的生長曲線。

（5）細胞劃痕實驗檢測細胞遷移侵襲能力：將處理后的轉染細胞，按照2×105/ml的密度，接種入含有玻片的24孔的板內，然后將l ml的細胞懸液加入每孔內，輕輕的混勻。在完全培養基上孵育48 h后，然后更換1%的胎牛血清的DMEM培養液，繼續孵育。然后用100 μl的無菌tip頭在玻片上垂直劃2條平行線，后用PBS清洗1次；分別在培養0 h和48 h時取玻片觀察。用PBS清洗取出的玻片3次，然后將玻片放進用甲醇∶乙酸（3∶1比例）的固定液中約固定30 min后，取出玻片后用PBS清洗3次并晾干。然后使用吉姆薩染液對玻片進行染色15 min后，使用清水清洗玻片，晾干后放置在顯微鏡下拍照觀察。計算劃痕修復率。

劃痕修復率=（0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度×100%。

1.2.3 小鼠肝癌移植模型及腫瘤進展觀察

（1）原位肝癌模型（肝門靜脈注射組）：將小鼠分為3組，即空白對照組、LHX6基因低表達組以及LHX6基因高表達組，空白對照組每組10只小鼠，其余兩組每組15只小鼠，雄性。收集處于生長對數期的轉染細胞，按照LHX6基因高低表達將兩組細胞分別稀釋至2×106cells/ml，在無菌條件下各取250 μl細胞懸液對LHX6基因低表達組以及LHX6基因高表達組小鼠進行肝門靜脈接種，各接種12只。對照組小鼠在肝門靜脈接種等量的生理鹽水。每周觀察1次，連續觀察4周，觀察瘤塊大小、皮下浸潤、遠處轉移和腹腔播散情況，記錄皮下腫瘤生長曲線。

（2）皮下肝癌模型（腋部皮下注射組）：皮下動物模型則將細胞懸液接種于腋部皮膚皮下，分組情況、觀察情況與原位肝癌模型一致。

（3）觀察指標：接種肝癌細胞后，觀察小鼠的精神狀態、飲食飲水等一般狀況及死亡情況。在種植肝癌細胞后的7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天，用游標卡尺測量每次觀察時皮下腫瘤大小，按下列公式計算腫瘤體積（tumor volume，TV），TV=0.5×a×b2（其中a、b分別表示長、寬）。

（4）解剖學及組織病理學觀察：4周后，采用頸椎脫臼法處死實驗動物，進行大體解剖觀察，肉眼觀察瘤體的大小、形態、有無胸腹水及各臟器表面有無轉移性結節，稱取瘤體質量；分離腫瘤組織，置于40 g/L甲醛中固定，然后進行石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察瘤組織形態。

1.3 統計學方法 本研究數據均用SPSS 22.0統計軟件處理，計量資料數據用“”表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間均數的兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色表達狀況

2.1.1 LHX6基因、E-cadherin、Vimentin、Snail在肝癌組織及癌旁組織的表達 LHX6基因在肝癌組織中表達熒光強度值為（0.177±0.086），表達強度低，而在癌旁組織中表達量為（0.475±0.212），強度明顯增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。E-cadherin在肝癌組織表達熒光強度值為（0.093±0.022），較癌旁組織相對表達量（0.177±0.127）顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Vimentin在肝癌

組織表達熒光強度值為（0.702±0.452），較癌旁組織相對表達量（0.436±0.115）顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Snail在肝癌組織表達熒光強度值為（0.633±0.215），較癌旁組織相對表達量（0.376±0.201）顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。LHX6基因的表達與E-cadherin的表達呈正相關，與Vimentin、Snail的表達呈負相關。

2.1.2 免疫組化檢測LHX6基因、E-Cadherin、Vimentin、Snail在肝癌組織及癌旁組織的表達 通過鏡下觀察可見LHX6在肝癌組織中表達較為低下，而相鄰的癌旁組織中呈現較高表達，表達主要部位在細胞核，可見腫瘤細胞核中大量棕黑色顆粒；E-Cadherin在肝癌組織中幾乎不表達，而相鄰的癌旁組織中呈現高表達，表達主要部位在細胞膜，可見紅棕色顆粒圍繞細胞；Vimentin在肝癌組織中呈現高表達，而在相鄰的癌旁組織中基本不表達，表達主要部位在細胞質內，可見棕黃色顆粒；Snail同樣在肝癌組織中呈現高表達，而在癌旁組織中基本不表達，表達主要部位在細胞核中，可見核內富有棕黃色染色顆粒。

2.1.3 LHX6基因、E-Cadherin、Vimentin、Snail與臨床病理特征和預后間關系 利用方差分析檢驗可知，肝癌組織中LHX6基因的表達與包膜侵襲、遠處轉移、腫瘤直徑有關（P＜0.05）；E-Cadherin的表達與門脈侵襲、包膜侵襲、遠處轉移、病理分級有關（P＜0.05）；Vimentin的表達與門脈侵襲、包膜侵襲、遠處轉移、腫瘤直徑有關（P＜0.05）；Snail的表達與門脈侵襲、包膜侵襲、轉移有關（P＜0.05）。在預后方面，LHX6基因、E-Cadherin的高表達與Vimentin、Snail的低表達是促進肝癌預后的保護因素，反之LHX6基因、E-Cadherin的低表達與Vimentin、Snail的高表達則是肝癌預后的危險因素。

2.2 體外細胞培養

2.2.1 轉染LHX6在HepG2肝癌細胞系中的表達情況 運用RT-PCR方法測定轉染LHX6在HepG2肝癌細胞系中的表達情況，發現質粒轉染組與空白對照組、siRNA轉染組中的LHX6的表達水平比較結果差異顯著（P＜0.05），這表明，質粒轉染可以上調LHX6表達，而siRNA轉染可以下調LHX6表達，見圖1。2.2.2 轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系增殖的影響 運用MTT方法測定轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系增殖的影響，發現質粒轉染組與空白對照組、siRNA轉染組中的肝癌細胞增殖情況比較結果差異顯著（P＜0.05），這表明，高表達LHX6可以抑制肝癌細胞增殖，而低表達LHX6可以促進肝癌細胞增殖，見圖2。

圖1 轉染LHX6在HepG2肝癌細胞系中的相對表達量Figure1 The Relative Expression Level of Transfected LHX6 in HepG2 Liver Cancer Cell Lines

圖2 轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系增殖的影響Figure 2 Effect of transfection of LHX6 on the proliferation of HepG2 hepatocellular carcinoma cell line

2.2.3 轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系遷移侵襲能力的影響 運用細胞劃痕實驗測定轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系遷移侵襲能力的影響，發現質粒轉染組與空白對照組、siRNA轉染組中的肝癌細胞遷移侵襲能力比較結果差異顯著（P＜0.05），這表明，高表達LHX6可以抑制肝癌細胞的轉移，而低表達LHX6可以促進肝癌細胞的轉移，見圖3。

圖3 轉染LHX6對HepG2肝癌細胞系遷移侵襲能力的影響Figure 3 Effect of transfected LHX6 on migration and invasive ability of HepG2 hepatoma cell line

2.3 小鼠肝癌移植模型及腫瘤進展觀察

2.3.1 原位肝癌模型（肝門靜脈注射組）

（1）移植腫瘤模型成模情況：15只LHX6基因低表達組小鼠全部移植成功，成瘤率100%；15只LHX6基因高表達組小鼠中有11只移植成功，成瘤率73.3%；10只對照組小鼠中無移植成功者，成瘤率0%。實驗按照計劃完成，無小鼠死亡。LHX6基因低表達組小鼠實驗結束時腫瘤最大長度已達18.4 mm；LHX6基因高表達組小鼠腫瘤生長速度較為緩慢，實驗結束時腫瘤最大長度為11.2 mm。

（2）腫瘤生長情況：實驗結束時稱取兩組小鼠腫瘤質量，經過分析發現LHX6基因低表達與LHX6基因高表達所形成的腫瘤質量有統計學意義（P＜0.05），LHX6基因低表達組的腫瘤質量明顯高于LHX6基因高表達組，見表2。

表2 各組皮下肝癌模型腫瘤質量（）Table 2 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

表2 各組皮下肝癌模型腫瘤質量（）Table 2 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

腫瘤質量（g）1.606±0.132 0.832±0.064 0組別名稱LHX6基因低表達組LHX6基因高表達組空白對照組

（3）遠處轉移和腹腔播散情況：實驗晚期，LHX6基因低表達組15只小鼠中，出現肝內、皮下、腹腔等廣泛腹腔淋巴結轉移例的10例，轉移率為66.7%；出現血性腹水者有4例，占26.7%。LHX6基因低表達組15只小鼠中，出現肝內、皮下、腹腔等廣泛腹腔淋巴結轉移的有3例，轉移率為20%；出現血性腹水者有1例，占6.7%。

（4）解剖學及組織病理學情況：在本實驗中，瘤體形態較為規則，圓形或橢圓形，周圍有完整或不完整的包膜，整體呈現大小不等的結節狀改變，外周有明顯增粗的血管，較大的瘤體中心則出現干酪樣壞死；晚期則可見肝內、皮下及腹腔的廣泛轉移。HE染色后可見腫瘤組織呈彌散樣，間質內有豐富的腫瘤血管，腫瘤邊緣已開始浸潤肝組織；腫瘤細胞核大，圓形，雙核仁結構明顯，游離核糖體顯著增多，部分內質網擴張，與人肝癌細胞類似。與LHX6基因高表達組相比，LHX6基因低表達組的瘤體及鏡下形態都更為完整典型，遠處轉移和浸潤情況都更為嚴重，說明在本實驗研究條件下，LHX6基因的低表達是抑制肝癌侵襲、轉移的一個因素。

2.3.2 皮下肝癌模型（腋部皮下注射組）

（1）移植腫瘤模型成模情況：15只LHX6基因低表達組小鼠全部移植成功，成瘤率100%；15只LHX6基因高表達組小鼠中有7只移植成功，成瘤率46.7%；15只對照組小鼠中無移植成功者，成瘤率0%。實驗按照計劃完成，無小鼠死亡。LHX6基因低表達組小鼠腫瘤生長較快，實驗結束時腫瘤最大長度已達12.4 mm；而LHX6基因高表達組小鼠腫瘤生長速度較為緩慢，實驗結束時腫瘤最大長度為7.9 mm。

（2）腫瘤生長情況：根據實驗數據計算腫瘤體積TV（mm3），并繪制腫瘤生長曲線（圖4），可以發現：LHX6基因低表達組腫瘤體積增長速度較快，LHX6基因高表達組腫瘤體積增長速度較慢，并且隨著實驗進程的發展，腫瘤增長速度也在增加。經方差分析，兩組之間的差異有統計學意義（F=10.87，P＜0.01）。實驗結束時稱取兩組小鼠腫瘤質量，經過分析發現LHX6基因低表達與LHX6基因高表達所形成的腫瘤質量有統計學意義（P＜0.05），LHX6基因低表達組的腫瘤質量明顯高于LHX6基因高表達組，見表3。

（3）皮下浸潤和遠處轉移情況：實驗晚期，LHX6基因低表達組15只小鼠中，出現皮下浸潤和淋巴結轉移例的有10例，轉移率為66.7%；LHX6基因高表達組15只小鼠中，出現皮下浸潤和淋巴結轉移的有4例，轉移率為26.7%。皮下肝癌的轉移主要沿淋巴系統轉移。

圖4 皮下肝癌模型腫瘤生長曲線Figure 4 Subcutaneous hepatocellular carcinoma model tumor growth curve

表3 各組皮下肝癌模型腫瘤質量（）Table 3 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

表3 各組皮下肝癌模型腫瘤質量（）Table 3 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

腫瘤質量（g）0.514±0.055 0.397±0.081 0組別名稱LHX6基因低表達組LHX6基因高表達組空白對照組

（4）解剖學及組織病理學情況 在本實驗中，瘤體呈圓形或類圓形，周圍有完整或不完整的包膜，整體呈大小不等的顆粒狀或結節狀改變，部分瘤體可見干酪樣壞死；晚期則出現皮下浸潤和遠處淋巴轉移。HE染色后可見腫瘤細胞形態多樣，大部分形狀不規則，有1個或多個核仁，核仁結構明顯，病理性核分裂像多見，部分細胞伴有炎癥細胞浸潤，與人肝癌細胞類似。與LHX6基因高表達組相比，LHX6基因低表達組的瘤體及鏡下形態都更為完整典型，皮下浸潤和遠處轉移都更為嚴重，說明在本實驗研究條件下，LHX6基因的低表達是抑制肝癌侵襲、轉移的一個因素。

3 討論

LHX6基因位于人染色體9q33.2位置，全稱是Homo sapiens LIM homeobox 6。其產物屬于LIM蛋白家族，可結合DNA和蛋白質，作為轉錄因子存在，在胚胎發育過程中有重要作用，同時還與牙齒發育、神經細胞遷徙定位有關[10-11]。近些年來新研究表明LHX6基因很可能是頭頸癌的相關基因[12]，并且在宮頸癌、肺癌、結腸癌等腫瘤的診斷中可能有重要價值。盡管如此，LHX6基因在肝癌中的具體分子機制以及在臨床預后中的意義目前還不清楚。

前期實驗中，我們通過對54例肝癌組織標本檢驗發現，LHX6在肝癌組織中呈顯著低表達，并且其表達水平與肝癌臨床病理因素相關，包括病理分級、腫瘤大小等。本次實驗中，我們收集80例肝癌組織標本，通過免疫組織化學染色觀察肝癌侵襲指標的表達狀況，同時進行了體外和體內的肝癌細胞培養，從多方面探索LHX6基因在肝癌轉移中的表達、作用以及可能的臨床意義。

肝癌動物模型是進行肝癌實驗研究的重要手段，目前已經建立的模型有動物自發性肝癌模型、誘發性肝癌模型、移植性動物肝癌模型、人類肝癌的異種移植模型以及轉基因動物肝癌模型，本次實驗采用的是移植性肝癌模型。移植性肝癌模型是指能夠在同系、同種或異種動物體內傳代生長的肝癌，他的組織學類型、生長特性較穩定，侵襲、轉移以及對化療藥物的敏感程度比較容易確定，是目前進行腫瘤發生發展和抗癌藥物研究的有效方式[13]。本次實驗室用的人肝癌細胞株HepG2，已經廣泛用于相關藥物與基因對肝癌細胞誘導凋亡以及生物學性狀的研究，取得了一定的進展[14]。同時有關研究表明[15]，在肝癌移植模型中，雄性動物比雌性動物更易引發肝癌，為了提高腫瘤的形成率，實驗中我們全部使用了雄性小鼠。

通過實驗我們發現，LHX6基因、E-Cadherin的高表達與Vimentin、Snail的低表達是促進肝癌預后的保護因素。高表達LHX6可以抑制肝癌細胞的增殖和轉移，而低表達LHX6可以促進肝癌細胞的增殖和轉移，兩者呈負相關關系。這說明，LHX6與上皮細胞向間質細胞的轉變各指標具有相關性，通過促進LHX6基因、E-Cadherin的表達和抑制Vimentin、Snail的表達有助于提高肝癌的總體治療效果。在未來的肝癌治療中，LHX6基因有可能成為肝癌靶向治療的有效藥物靶點，通過藥物治療上調LHX6的表達，抑制肝癌細胞的增殖和轉移，為肝癌治療提供一種新途徑，同時可根據腫瘤細胞中LHX6基因表達的高低判斷預后情況，調整治療方案，提高肝癌患者的生存周期及生活質量。由于LHX6基因在肝癌發生發展上的作用仍不十分明確，其機制有待進一步探究。