貴州地區82例地中海貧血產前篩查基因診斷結果分析

吳莎莎　何志旭　金皎　黃璟　袁軍

[摘要]目的 了解貴州地區孕期夫婦及胎兒的地值海貧血基因突變類型，為我省地中海貧血遺傳學咨詢提供參考資料。方法 收集2012年10月～2014年10月在貴州醫科大學附屬醫院及貴州省人民醫院產前診斷中心行地中海貧血產前診斷的患者資料，通過血常規及血紅蛋白電泳檢測篩查，再通過反向點雜交（RDB）和聚合酶鏈反應（PCR）法行地中海貧血的基因分型。結果 ①82例患者中，共檢出α-地中海貧血26例，占31.7%，檢測出中國人最常見的缺失型α地中海貧血（-SEA、α3.7、α4.2）；β地中海貧血患者56例，占68.3%，檢測出中國人常見的7種基因突變類型，以CD17（A→T）、CD41-42（-TCTT）、IVS-2-654（C→T）最常見。②雙方基因診斷為均攜帶α地中海貧血或攜帶有β地中海貧血的夫妻有51對，采用抽臍血或羊水的方式進行產前基因診斷，產前診斷為輕型地中海貧血的胎兒33例，地中海貧血陰性胎兒10例，中重型地中海貧血胎兒8例。其中，產前診斷檢測出患有重型β-地中海貧血的胎兒5例，1例胎兒為bart′s水腫胎，2例胎兒患有血紅蛋白H病，均采取終止妊娠的措施。結論 地中海貧血患者的發生率有較為顯著的差異，但其基因突變率有相似的趨勢，其中，β-地貧基因攜帶者的檢出率明顯要高于α-地貧基因攜帶者；通過產前篩查可以避免重型及中間型地中海貧血患兒的出生。

[關鍵詞]地中海貧血；基因型；遺傳篩查；產前診斷

[中圖分類號] R725.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（a）-0124-03

[Abstract]Objective To understand the types of thalassemia gene mutations in the couples during pregnancy and their fetuses in Guizhou Region and to provide reference data for the genetic consultation of thalassemia in our province.Methods Data were collected on the patients who were given prenatal diagnosis of thalassemia in the Prenatal Diagnosis Center of the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University and Guizhou People′s Hospital from October 2012 to October 2014.Screening was performed by routine blood test and hemoglobin electrophoresis test，and the genotyping of thalassemia was performed by RDB and PCR.Results ①In the data of 82 patients，26 cases of α-thalassemia were detected，accounting for 31.7%.The most common deletion type-α thalassemia in the Chinese people（-SEA，α3.7，α4.2） was detected；56 cases of β-thalassemia were detected，accounting for 68.3%.The seven genetic types of mutations that were common in the Chinese people were detected，with the most common types of CD17（A→T），CD41-42（-TCTT），and IVS-2-654（C→T）.②There were 51 couples who both carried α-thalassemia or β-thalassemia according to the genetic diagnosis.Prenatal genetic diagnosis was carried out by collecting cord blood or amniotic fluid.There were 33 cases of fetuses with prenatal diagnosis of mild thalassaemia，10 cases of fetuses with negative thalassemia，and 8 cases of fetuses with moderate to severe thalassemia.Among them，there were 5 cases of fetuses with severe β-thalassemia according to the prenatal diagnosis.One case of fetus was bart′s edema，and two cases of fetuses had hemoglobin H disease.All of them were given the measures to terminate the pregnancy.Conclusion There is a significant difference in the incidence rate of thalassemia.However，there are similar trends in the rates of gene mutation.Among them，the detection rate of β-thalassemia carriers is significantly higher than that of α-thalassemia carriers；through prenatal screening，the birth of the infants with severe and intermediate thalassaemia can be avoided.

[Key words]Thalassemia；Genotype；Genetic screening；Prenatal diagnosis

地中海貧血是由于珠蛋白肽鏈合成受到部分或完全抑制，造成肽鏈合成不平衡所引起的一組遺傳性溶血性貧血，分為α地中海貧血和β地中海貧血。α和β-地中海貧血是我國南方（廣東、廣西和海南）最常見、發病率最高、也是危害最大的人類單基因遺傳病之一[1]。貴州省也為地中海貧血高發地區之一。目前因為對地中海貧血重型患者缺乏特別有效的治療辦法，因此提早檢查出該病攜帶者及對可疑孕婦進行產前基因的診斷是防止重型、中間型地中海貧血患兒出生的唯一有效措施，從而可以很大程度提高這一地區的人口素質。廣西、廣東等少數南方省份的β地中海貧血分子流行病學特征已有部分報道[2-3]。貴州省較鄰近省份對本地區地中海貧血的研究報道較少，這將不利于在本地區開展該病的遺傳咨詢和產前診斷工作。為此，對貴州地區的地中海貧血基因突變頻率進行調查，可以為該省各地有效開展地中海貧血防治工作提供重要的參考依據。本研究對貴州地區地中海貧血孕婦進行產前基因檢測，現將結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年10月～2014年10月在貴州醫科大學附屬醫院及貴州省人民醫院行地中海貧血產前診斷的患者，對82例地中海貧血基因檢測陽性者進行研究。

1.2研究方法

1.2.1主要儀器、試劑 PCR擴增儀為E-Cycler TM 96 PCR，PCR產物電泳結果用Syngene凝膠成像系統分析，由深圳益生堂生物企業有限公司提供DNA提取試劑、α-地中海貧血基因分型檢測試劑盒。

1.2.2檢測方法 ①臨床血液學檢查：血細胞自動分析儀測定血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白，平行篩查Hb<110 g/L，MCV<80 fl，MCH<27 pg，如有異常，則疑診為地中海貧血，納入篩查檢查。②血紅蛋白電泳：經過檢查，如HbA2值<2.5%時，高度懷疑為α地中海貧血攜帶者；如HbA2值>3.5%時，則高度懷疑為β地中海貧血基因攜帶者[4]，需行下一步的基因分析。③DNA提取：采集上述篩查后結果陽性患者，取其抗凝靜脈血（2～3 ml），再取其高風險胎兒臍帶血（1.5～2.0 ml）或羊水（5～20 ml），采用血液DNA提取試劑盒（深圳益生堂公司提供的全血基因組提取試劑盒和基因診斷試劑盒）提取。擬產前診斷胎兒均在B超引導下經腹穿刺抽取臍靜脈血（1.5～2.0 ml）或羊水（5～20 ml）。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0醫學統計軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1地中海貧血的基因診斷

α-地中海貧血26例，占31.7%，β-地中海貧血56例，占86.3%。26例α-地中海貧血中，檢出中國人常見的缺α地中海貧血（-SEA、α3.7、α4.2），所檢出基因類型及構成比（表1）。56例β-地中海貧血陽性標本中，檢出中國人常見的7種基因突變類型，未檢出基因突變位點的罕見基因類型，基因分析結果（表2）。

2.2產前診斷情況

對夫妻雙方均為同型地中海貧血攜帶者的51對夫婦抽臍血或羊水進行產前基因診斷，其中在妊娠中期（16～20周）經羊膜腔穿刺抽取羊水44例，孕中晚期（18～26周）行經腹臍靜脈穿刺術7例。產前診斷為輕型地中海貧血的胎兒有33例，地中海貧血陰性胎兒10例，中重型地中海貧血胎兒8例，其中產前診斷檢測出重型β-地中海貧血胎兒5例，1例bart′s水腫胎，2例血紅蛋白H病，均采取終止妊娠的干預措施。比較臍靜脈穿刺、羊膜腔穿刺這兩種方法（χ2=2.573，P=0.393），在地中海貧血的檢出率中這兩種方法差異無統計學意義。兩種產前診斷方法在地中海貧血中的檢測情況（表3）。

3討論

地中海貧血，又稱海洋性貧血，是海南、廣東、廣西省影響最大、發病率最高的一類疾病，為遺傳性血紅蛋白病。全球大約1.5%的人口為地中海貧血基因攜帶者，且每年有60萬重型地中海貧血患兒出生[5]。在這些地區的人群中，α型地中海貧血（包括HbH病）大概發生率為1.2‰～8.1‰，其中α重型地中海貧血發生率約為0.4‰[6-7]。而Hb Bart′s水腫胎兒常在患兒出生后數十分鐘內死亡或于妊娠晚期死于母腹中。而患β型重型地中海貧血患兒，常依賴頻繁輸血得以生命的維持，對于地中海貧血目前國際國內均無有效的治療方法，地中海貧血患兒的出生，尤其是中重型患兒的出生，給社會和家庭均帶來沉重負擔。因此，目前只有防止地中海貧血患兒的出生方能有效預防地中海貧血。目前α地中海貧血基因突變類型已知最少有77種，其中33種為缺失性突變，44種是點缺失[6]。在我國，α地中海貧血常見的主要有3種突變類型基因：一種為突變缺失一條染色體上兩個α珠蛋白基因，即α0突變；另一種為α+突變，包括-α4.2和-α3.7[8]。本研究中檢測出的26例α地中海貧血患兒以-SEA為主（占53.9%），其次是-α3.7，最后是-α4.2。

β型地中海貧血常是由于β珠蛋白基因點突變從而造成鏈mRNA生成減少，致使合成珠蛋白鏈減少，從而導致HbA全無或明顯缺乏[9-10]。據國內外文獻報道，β珠蛋白基因突變類型大概有360種以上，在不同種族、不同地區人群其基因突變類型各有差異[10]。本研究中56例β型地中海貧血患兒共檢測到β珠蛋白突變位點共7種，其中CD41-42（-TCTT）21例，CD17（A→T）16例，IVS-Ⅱ-654（C→T）13例，-28（A→G）2例，-29（A→G）2例，CD71-72（+A）1例，分別占37.5%、28.6%、23.3%、3.5%、3.5%、1.8%。

目前，我國主要通過CMV來篩查地中海貧血基因攜帶者，但CMV降低，也常見于患缺鐵性貧血患者，其診斷缺乏特異性[4]。有研究表明MCV、MCH靈敏度較高，但是特異性不足，容易出現假陽性[11]。特別是在地中海貧血高發地區，采用MCV、MCH兩個指標不能完全排除攜帶地中海貧血基因的風險[12]。雖血紅蛋白電泳檢查在該病診斷中意義相對較大，但對珠蛋白生成障礙性貧血中靜止型患者不能通過血紅蛋白電泳檢查進行有效的診斷。目前國際上對地中海貧血基因診斷的有很多種方法[13-15]，PCR結合反向斑點雜交法和Gap-PCR法這兩種技術均比較成熟，檢測的特異性強，可在有條件基層醫院推廣應用。地中海貧血由于其基因譜的復雜性，使得該病利用傳統基因方法診斷仍可能存在技術漏檢，因此對于臨床來說，建立一個更加優化、全面的地中海貧血疾病篩查及基因診斷技術平臺，將大大提高其基因缺陷檢出的水平，對檢出更多的缺陷基因攜帶者有很大的幫助，且可有效指導生育和婚配，從而對控制地中海貧血這一疾病的嬰兒出生缺陷具有重要的指導意義。

[參考文獻]

[1]賴劍鋒，陳蓮芬，張偉強.廣州市番禺區孕前檢查人群地中海貧血篩查情況分析[J].現代醫院，2017，17（2）：214-216.

[2]Xu XM，Zhou YQ，Luo GX，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guandong Province：implications for the future health burden and population screening[J].J Clin Pathol，2004，57（5）：517-522.

[3]Pan HF，Long GF，Li Q，et al.Current status of thalassemia in minority population in Guangxi，China[J].Clin Genet，2007， 71（5）：419-426.

[4]胡亞美、江載芳.諸福棠實用兒科學[M].北京：人民衛生出版社，2008.

[5]Higgs DR，Engel JD，Stamatoyannopoulos G.Thalassemia[J].Lancet，2012，379（9813）：373-383.

[6]杜娟，覃靜.16443例地中海貧血結果分析與研究[J].中國婦幼保健，2008，23（32）：4435-4436.

[7]黃凌.917例血紅蛋白電泳檢查結果分析[J].實驗與檢驗醫學，2009，27（3）：226-2276.

[8]杜傳書.地中海貧血研究的現狀與未來[J].中華醫學遺傳學雜志，1996，13（5）：257-259.

[9]Galbiati S，Brisci A，Damin F，et al.Fetal DNA in maternal plasma：a noninvasive tool for prenatal diagnosis of beta-thalassemia[J].Expert Opin Biol Ther，2012，12（Suppl1）：S181-187.

[10]Firdous N，Gibbons S，Modell B.Falling prevalence of beta-thalassemia and eradication of malaria in the Maldives[J].J Community Gent，2011，2（3）：173-189

[11]羅景荷.MCV、MCH及血紅蛋白A2檢測在地中海貧血篩查中的價值[J].中華婦產科雜志，2012，47（2）：276-277.

[12]李愛敏，唐曙明，陳海霞，等.血液學初篩表型陰性的孕婦地中海貧血基因檢測結果分析[J].實驗與檢驗醫學，2015，（5）：576-577.

[13]周玉球，肖鴿飛，李莉艷，等.Gap-PCR作為臨床一線α-地中海貧血攜帶者篩查技術的應用評價[J].第一軍醫大學學報，2002，22（5）：434-436.

[14]周代鋒，王政，鮑時翔，等.用等位基因特異性PCR進行β-地中海貧血產前基因診斷[J].海南醫學院學報，2007， 13（1）：8-10，32.

[15]梁玉全，周遠青，梁瑞蓮.反向斑點雜交技術用于β-地中海貧血的基因診斷及產前診斷[J].實用醫學雜志，2005， 21（15）：1710-1711.

（收稿日期：2018-02-05 本文編輯：崔建中）