提高羔羊超排效果的技術措施

佟桂芝 海龍 李信濤 董正德 王偉霞 宋斌 李玉龍 郭立宏 王嘉厚

摘要：羔羊卵母細胞作為體外胚胎生產的試驗材料，越來越多地得到國內外研究人員的廣泛關注。為了利用羔羊超數排卵的卵子擴展體外受精所需卵子的來源、縮短世代間隔、產生大量優秀后代、加速育種進程，國內外學者紛紛進行了羔羊超排后進行活體采卵及體外受精、胚胎移植實驗，目前已經取得了一定的成果。但總體效率還不是很高，利用羔羊作為供體來生產胚胎時，常出現個體對激素誘導無任何反應現象。本文對生殖激素的使用、羔羊超排反應、卵母細胞發育效率、卵母細胞的基因表達、卵母細胞及受精卵培養體系的優化等影響因素進行總結與分析，提出羔羊超排存在的問題并展望其發展前景，為這一技術能在更多家畜繁殖領域的商業化生產提供參考資料。

關鍵詞：羔羊;超數排卵;腹腔鏡采卵

中圖分類號：S826.3 文獻標識碼：B 文章編號：2095-9737（2018）10-0047-02

我國開展羔羊超排研究是從2005年著手開展引進，首先應用于肉羊繁殖育種上，2006年該技術應用于奶牛優良品種繁育上。該項技術的應用加快了良種的快速繁育，對推動我國養殖業的快速發展具有重要意義。目前應用羔羊卵母細胞進行胚胎生產的效率低下，仍然需要進一步研究。同時，羔羊卵泡發育效果受許多因素的影響，如羔羊品種、激素處理方法、采卵方法等。為提高羔羊體外胚胎生產效率，加大良種羊的擴繁速度和縮短育種世代間隔，現從羔羊超排方法、卵子不同采集方法、超排月齡、品種等因素對超排后卵母細胞數量的影響進行分析，為提高綿羊體外胚胎生產效率提供一定的理論依據。

1 羔羊月齡對超排羔羊卵泡發育和卵母細胞采集情況的影響

羔羊超排時月齡是影響超排效果的關鍵因素之一，超數排卵的目的是能實現卵母細胞的最大獲取量。Earl.CR等報道[1]，母羊在妊娠期的135天開始，胎兒卵巢上才開始出現有腔卵泡，出生時數量明顯增加。卵泡發育在羔羊出生后4～8周齡時達到高峰，但隨著青春期的到來開始減少。羔羊在1月齡時進行外源激素誘導后，卵巢上具有繁育過程中最多數目的卵泡發育。而后隨著年齡的增長，卵巢上發育的卵泡數有所下降，到初情期后保持相對穩定。于勇等[2]對1、3月齡羔羊進行外源激素FSH+PMSG處理，發現兩者卵巢上發育的卵泡數存在顯著差異，3月齡羔羊卵巢上發育的卵泡數僅為其1/4左右，顯著低于1月齡羔羊的卵泡數。不同月齡羔羊在相同激素處理下卵巢及子宮的發育情況FSH+PMSG處理后卵巢、子宮1月齡羔羊較3月齡羔羊變化明顯的結果相似。幼齡動物進行激素處理時，年齡是個重要的影響因素。

趙金紅（2015研究發現，4～8周齡羔羊組卵巢超排反應、回收卵母細胞數、可用卵母細胞數與8～12周齡、12～16周齡組差異顯著（P<0.05）。4～8周齡酉州烏羊幼羔在激素處理后卵巢長度和寬度明顯高于1216周齡組。Morton等[4]研究結果表明，羔羊出生后早期，繁殖器官生長明顯，4、8周齡時卵巢重量比出生時分別增加6.8倍和10.8倍，8～12周齡時卵巢增重開始下降，直至33周齡時保持恒定。Ptak等[5]研究表明，1月齡羔羊超排效果最好，3月齡最差。

2 羔羊出生重及超排時體重

影響超排效果的動物因素主要包括個體和遺傳的差異等。代相鵬等[6]的研究結果表明，體重和超排季節對供體超排效果沒有顯著影響。劉太宇等[7]的研究結果表明，授精方式等因素對超排效果沒有顯著影響。秦雪等[8]對6～8周齡的健康杜晉綿羊進行超數排卵，結果表明：初生重與卵母細胞數量呈極顯著正相關（P<0.01），超排時體重與卵母細胞數量相關不顯著（P>0.05）。超排時體重不是影響羔羊超排效果的主要因素。但是在實際生產中，應選擇初生重大及超排時體重良好的羔羊進行超數排卵，這些羊的體況及營養狀況都能夠達到更好的水平，有助于提高羊群的質量。

3 超排激素及超排方案對羔羊超排效果的影響

常規幼畜的超排方法主要是利用促性腺激素FSH（PMSG）和LH誘導其卵巢卵母細胞發育。目前羔羊超排方法一種是孕酮+促性腺激素法，另一種是促性腺激素法;主要有GnRH、FSH+LH法，獲得的卵母細胞數存在差別。Morton K M等[4]對30～40日齡的羔羊進行激素超排，每只羔羊平均得到86.2±7.9枚卵母細胞。Ptakt[5]等給1月齡的羔羊放置孕酮栓8天，第8天撤栓，第5～7天每天注射FSH2次，獲得平均每只羔羊29枚卵母細胞。胡鵬飛[9]對2月齡的雜種羊利用促性腺激素超排后平均獲得15.。枚卵母細胞。魯彥（2011）[10]采用兩種超排方案對新疆細毛羊羔羊進行超排：結果加拿大激素和寧波激素超排效果兩者采用等量法超排的卵母細胞數差異不顯著;加拿大激素減量法超排效果較差，寧波FSH超排卵數從20～230枚。Gou等數82枚。谷振慧[12]采用加拿大激素超排處理102只4～8周齡的羔羊，平均獲卵數79枚。秦雪（2014）[8]用FSH+PMSG方案獲得發育卵泡數顯著高于FSH+LH方案。FSH在體內的半衰期短，需要多次注射;PMSG單獨使用會導致未排卵的卵泡數量增加。陳童等[13]對4～9周齡的超細型澳洲美利奴。間隔12h連續進行6次FSH肌肉注射，FSH總劑量為120mg。其中一組在第5次注射FSH的同時，肌肉注射 PMSG 400萬IU，另外一組不注射PMSG。試驗在超排效果上不斷優化，使用國產激素達到了比較穩定而且較好的效果;卵母細胞回收率也在熟練中不斷提高?？朔萍s羔羊超排產業化應用的主要障礙。不斷完善幼畜超排方法、程序，以提高體外胚胎生產效率及探索適宜的超排方法來穩定超排效果。幼畜卵泡庫對于育種和科研等方面的意義和潛力絕對是不容忽視的。

4 采卵方法

手術采卵法：剖腹手術將卵巢和子宮引出體外，隨后抽吸卵泡液。與內窺鏡法相比，本法對羔羊的損傷較大，術后易發生黏連，但可以直觀的觀測卵泡的發育，卵回收率高。將供體羔羊保定好，肌注0.1mL左右靜松靈進行麻醉，縱向切一個3cm切口，從切口將卵巢拉出，用10mL注射器（提前吸有2mL抽卵液）抽吸卵巢上2～8mm卵泡液，抽卵結束時，將抽卵液轉移入50mL離心管，37℃水浴鍋中沉淀10～20min，在實體顯微鏡下選擇形態正常的卵子。采卵完畢，再往腹腔中倒人200mL預先溫35℃的生理鹽水。給羔羊注射0.1mL左右蘇醒靈。

腹腔鏡采卵法：借助腹腔鏡觀察卵巢狀態，然后利用操作桿和采卵針的配合將卵泡中的卵母細胞采集出來，具有手術切口小、對羔羊應激小、可重復性高等優點。但內窺鏡等設備價格昂貴。該法對羔羊傷害較小，羔羊可以重復超排，對成年后的生育能力并不受影響。

摘出卵巢取卵法：將羔羊卵巢摘取后帶回實驗室，用抽吸或切割的方法獲得卵母細胞。這種方法卵母細胞效率較高，減少了活體采卵時凝血的發生，但摘取卵巢后影響了母羊的使用價值。

供體羔羊每次超排處理所獲卵母細胞數量會隨重復超排次數的增加而逐漸減少，間隔3周重復超排，幼羔的獲卵數較初次超排降低。Morton K M等[4]認為卵巢對激素的反應性降低是導致重復超排所獲卵母細胞數量下降的主要原因。

參考文獻：

[1]Earl C R，Irvine B J，Kelly J M，et al.Ovrain stimulation proto-cols for oocyte collection andin vitro embryo production from 8to 9 week old lambs[J].Theriogenology，1995，43：203.

[2]于勇，鐘旭，王芬露，等.不同月齡綿羔羊卵泡發育的比較研究[J].中國畜牧雜志，2012，48（9）：17-21.

[3]趙金紅，趙金艷，彭海梅，等.不同周齡酉州烏羊幼羔超排及卵母細胞體外發育研究[J7.中國畜牧雜志，2015，46（3）：1-5.

[4]Morton K M，Catt S L，Maxwell W M，et al.Effects of lamb age，horrone stimulation and response to hormone stimulation on theyield and in vitro developmental competence of prepubertal lamboocytes[J].Reprod Fertil Dev，2005，17（6）：593-601.

[5]Ptak G，Loi P，Dattena M，et al.Offspring from one month oldlambs：studies on the developmental capability of prepubertal oo-cytes[J].Bio Reprod，1999，61：1568-1574.

[6]代相鵬，侯戰亮，王鋒，等.體況和季節等因素對供體波爾山羊超排效果的影響[J].家畜生態學報，2006，27（2）：28-33.

[7]劉太宇，靳雙星，張桂枝，等.影響山羊超排效果的因素研究[J].中國農學通報，2006，22（9）：27-30.

[8]秦雪，岳文斌，鄭亞琳，等.母羔自身因素與其超排卵母細胞數量的相關性分析[J].中國草食動物科學，2014，2：12-16.

[9]胡鵬飛，張貴學，于國慶，等.羔羊卵泡誘導發育、活體采卵和體外發育潛能研究[J].畜牧獸醫學報，2011，2：182-189.

[10]魯彥，常衛華，吳海鳳，等。羔羊超數排卵技術在綿羊快速繁殖技術中的應用研究[J].畜牧獸醫科技信息2011，11：26-29.

[11]Gou K M，Guan H，An XR，et al.Field evaluation of Juvenile invitro embryo transfer（JIVET）in sheep[J].Animal Reproduc-tion Science，2009，112（3～4）：316～324.

[12]谷振慧，王志剛，劉月琴，等.影響羔羊超數排卵及體外授精的因素[J].中國草食動物科學，2014，10：74-76.

[13]陳童，郝耿，楊會國，等.細毛羊羔羊超數排卵及體外胚胎生產移植[J].新疆農業科學2012，49（5）：940-944.