生鮮乳中黃曲霉毒素M1的不確定度測定

何立寧，趙興鑫，呂潔，趙義良，魏昆鵬，宋瑞

（石家莊市農業畜牧局，石家莊 050000）

0 引 言

生鮮乳中的黃曲霉毒素產生主要原因是由于奶牛采食了被黃曲霉和寄生曲霉的代謝物污染的飼料后，在奶牛體內代謝產氫的羥基化代謝物。歐盟規定，黃曲霉毒素M 1（簡稱AF M 1）在嬰幼兒配方奶粉和嬰兒特殊醫用食品中的限量值為0.025μg/kg，在牛奶中的限量值為0.050μg/kg[1]，在我國食品安全國家標準食品中真菌毒素限量（GB 2761-2017）中規定AF M 1在乳及乳制品、嬰幼兒配方食品、特殊醫學用途配方食品、輔食營養補充品、運動營養食品和孕婦及乳母營養補充食品中的限量均為0.5μg/kg[2]，由此可見準確測定AF M 1的含量尤為重要。

測量不確定度的定義為：表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數[3]。本文將參考JJF1059-2012《測量不確定度評定與表示》的相關要求，采用GB 5009.24-2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素M族的測定》第一法開展測量不確定度的評定，以便得到更加準確和可靠的檢測數據。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑：

ME203E電子天平，AB Sciex Triple Quad 5500液質聯用儀，Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，粒徑1.8μm），酶聯免疫親和柱（1 mL），AF M 1標準品（10.1μg/mL,99%），13C17-AF M 1（0.504μg/mL，98.3%）。

1.2 方法

參照GB 5009.24-2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素M族的測定》第一法同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法進行。

1.3 質譜參數

電離源：ESI（+）；檢測方式：多離子反應監測（MRM）；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣173 k Pa；溫度：550℃；噴霧氣：380 kPa；輔助加熱氣：380 kPa；碰撞氣：55 kPa。

1.4 液相色譜條件

流動相A為濃度5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B為甲醇-乙腈（1∶1）；流速為0.3 mL/min；進樣體積為10μL；梯度洗脫如表2所示。

2 結果與分析

2.1 測量結果不確定度的數學模型

試樣中AF M 1的殘留量為

表2 流動相洗脫梯度表

式中：X為AF M 1的量；ρ為上機液中AF M 1按照內標法在標準曲線中對應的質量濃度；V為最終定容體積；f為稀釋因子；m為試樣稱樣量。

2.2 不確定度來源分析

通過對整個實驗過程和數學模型的分析，生鮮乳中AF M 1測定的不確定度因素及其影響來源如下：

（1）上機液中AF M 1按照內標法在標準曲線中對應的質量濃度c引入的不確定度；（2）最終定容體積V引入的不確定度；（3）試樣稱樣量m引入的不確定度；（4）樣品中加入內標引入的不確定度；（5）檢測儀器引入的不確定度。

3 標準不確定度分量的評定

3.1 AF M 1的質量濃度引入的不確定度

3.1.1 由標準品濃度引入的不確定度

通過AF M 1標準物質證書可知，標準品濃度的準確度為標識濃度的±0.42μg/mL，屬于正態分布，包含因子k=2，標準品濃度為10.1μg/mL，則其相對標準不確定度為

3.1.2 由內標濃度引起的不確定度

通過AF M 1的內標物證書可知，內標物濃度的準確度為標識質量濃度的±0.008μg/mL,屬于正態分布，包含因子k=2，內標物質量濃度為0.504μg/mL，則其相對標準不確定度為

3.1.3 引入的標準不確定度

標準儲備液及內標物稀釋過程中引入的不確定度主要來自移取標液和定容時引入的不確定度。用1 mL的移液器移取質量濃度為10μg/mL的標準品1 mL，定容至100 mL，得到質量濃度為100 ng/mL的工作液和用1 mL的移液器移取質量濃度為0.5μg/mL的標準品1 mL，定容至10 mL，得到50 ng/mL的內標物工作液。

100 mLA級容量瓶的容量允許差為±0.1 mL[5]，不考慮溫度對其膨脹系數的影響，按均勻分布考慮，k=，可計算出100 mLA級容量瓶定容引入的標準不確定度為：

10 mL A級容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，不考慮溫度對其膨脹系數的影響，按均勻分布考慮，k=，可計算出10 mL A級容量瓶定容引入的標準不確定度為：

1 mL移液器經檢定后的容量相對誤差為-0.6%，則該移液器的最大誤差為0.006 mL，按均勻分布考慮，可計算出該1 mL移液器引入的標準不確定度為：

標準儲備液和內標物稀釋過程中引入的標準不確定度Ud為

3.1.4 量器校準引入的標準不確定度

分別準確移取質量濃度為100 ng/mL的工作液5，10，50，100，200，500μL至10 mL容量瓶中，加入100μL質量濃度50 ng/mL內標工作液，用初始流動相定容至刻度，得到質量濃度為 0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL的系列標準溶液。該過程的標準不確定度主要是通過移液和定容過程引入的（見表3）。

表3 不同移液器引入的不確定度計算結果

已知10 mL A級容量瓶定容引入的標準不確定度為：0.00115，則標準工作曲線配制過程中量器校準引入的標準不確定度UVc為

3.1.5 添加過程中引入的不確定度

配置質量濃度為50 ng/mL的同位素內標工作液：取AF M 1同位素內標（0.5μg/mL）1 mL，用乙腈稀釋至10 mL。用量成為100～1 000μL的移液器準確移取，查該移液器檢定證書，其1 000μL的容量相對誤差為-0.6%，其不確定度為6μL,標準不確定度為0.006。10 mL的A級容量瓶定容引入的標準不確定度為0.00115。

在標準系列工作液中加入100μL質量濃度為50 ng/mL的同位素內標工作液。100μL移液器的標準不確定度為0.0058。

則標準工作曲線中內標物配置和添加過程中引入的不確定度UVis為：

3.1.6 標準曲線擬合產生的不確定度

測定質量濃度為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL標準溶液，測得其峰面積結果如表4所示。

表4 標準溶液濃度-峰面積結果

以峰面積和濃度作標準曲線，采用最小二乘法進行線性擬合，得到標準曲線方程為A=133942c-6732.8，R2=0.999，其中斜率為133942，截距為-6732.8，對樣品進行二次測量，有標準曲線求得樣品中AF M 1的質量濃度為1.730 ng/mL。

取樣液連續上機測試8次，結果如表5所示。

表5 取樣液連續上機測試8次的儀器測量結果

表5可以看出，極差R=11949，屬于A類評定，由于測量次數較少，依據相關標準采用極差法進行評定，其中n=8，C=2.85，故樣液峰面積測量引入的相對標準不確定度UA為

樣液中AF M 1的濃度引入的標準不確定度Uc為

3.2 最終定容體積V引入的不確定度

樣品經提取、凈化后，收集全部洗脫液，在50℃氮氣下緩慢吹至盡干，用初始流動相定容至1.0 mL。已知1 mL移液器的標準不確定度為0.006。

3.3 試樣稱樣量m引入的不確定度

根據標準要求，準確稱取4 g混合均勻的樣品，查電子天平檢定證書，在量程為0～50 g時，最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布進行計算，則；天平檢定結果誤差為0.2 mg，則；計算稱樣過程中所引入的標準不確定度；由于Um遠小于其他幾個分量的不確定度，故舍去。

3.4 樣品中加入內標引入的不確定度

在樣品中加入100μL質量濃度為5 ng/mL的AF M 1同位素內標工作液。100μL移液器的標準不確定度為0.0058。

質量濃度為5 ng/mL的AF M 1同位素內標工作液的配置：取AF M 1同位素內標（質量濃度0.5μg/mL）100μL，用乙腈稀釋至10 mL。引入的不確定度包括100μL移液器和10 mL容量瓶，標準不確定度分別為0.0058和0.00115。

則樣品中加入內標引入的不確定度UI為0.0083。

3.5 串聯質譜儀引入的不確定度

儀器檢定結果中，相對擴展不確定度為3%，k=2，則相對標準不確定度為UMS=0.03/2=0.015。

4 合成標準不確定度

以上各不確定度分量互不相關，則生鮮乳中AF M 1檢測結果的相對不確定度為

5 擴展不確定度的計算

本研究中測定樣品中的AF M 1質量分數為0.406 μg/kg，可以計算出合成標準不確定度，即Ux=0.406 μg/kg×0.0996=0.040μg/kg；取k=2,此樣品中AF M 1質量分數的擴展不確定度為U=2Ux=0.08μg/kg。

6 結果

樣品中AF M 1質量分數測定結果用測量不確定度的形式可表示為（0.406±0.08）μg/kg，取包含因子k=2。