菲律賓蛤仔外套膜液含氮物 分布特性及貯藏變化

張 晴,冷寒冰,徐美祿,周晏琳,于 笛,田元勇,劉俊榮,*

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023; 2.遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是我國重要的海水養殖經濟貝類。2016年,我國蛤類養殖總產量為417.3萬噸,占海水貝類養殖產量的29.4%[1]。菲律賓蛤仔的突出特點是產量大且抗脅迫能力強,其活品及各種傳統或現代加工品深受消費者喜愛。國內外學者對菲律賓蛤仔的研究一直處于熱潮,研究方向一方面以產業化養殖為主,包括繁殖、養殖和遺傳等[2-3];另一方面作為一種環境檢測物,探究菲律賓蛤仔對一些重金屬類(Hg、Pb等)環境污染物的富集作用[4-7];而從食品的角度出發,菲律賓蛤仔的相關研究主要在其捕后品質變化[8]、營養分析及加工利用等方面[3]。

菲律賓蛤仔是一種軟體部分全部可食的貝類,傳統工藝和現代工業化生產中大多選用軟體部分來制作產品,而菲律賓蛤仔中被忽略掉的外套膜液部分也占有很高的含量,菲律賓蛤仔蒸煮液中,蛋白含量和總糖含量占到干物質的80%以上[9]。因此,研究者逐漸把注意力轉移到對菲律賓蛤仔外套膜液的加工利用上。張龍等[10]對菲律賓蛤仔軟體各組織的一般化學組成和蛋白組成進行了系統的研究,而對于外套膜液的相關研究幾乎沒有。因此,本研究主要以菲律賓蛤仔外套膜液為原料,對外套膜液含氮物分布進行較為系統的分析,并對不同貯藏條件下外套膜液的主要組成物質進行分析,為提升菲律賓蛤仔經濟利用價值做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活品菲律賓蛤仔 于2017年10月購于遼寧省丹東市大鹿島;標準牛血清蛋白 中國北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚綠 上海麥克林生化科技有限公司;CuSO4、K2SO4分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司;H2SO4、NaOH、HCl、硼酸、乙醚 分析純(AR),中國天津市科密歐化學試劑有限公司;苯酚 天津市凱信化學工業有限公司;以上化學試劑 均為分析純。

高速冷凍離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司;AE-6500垂直電泳槽 日本ATTO公司;UV-1800PC 紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;101-1型電熱鼓風干燥機 上海實驗儀器廠有限公司;日立L-8900全自動氨基酸分析儀 天美(中國)科學儀器有限公司;BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;IMS-40全自動雪花制冰機 常熟市雪科公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理及貯藏 采捕上岸后低溫干藏6 h運至實驗室后,立即進行分選剔除破損死亡個體后進行貯藏處理。蛤仔樣本分為原料組和三個處理組,即原料組(Raw)、室溫濕藏組Wa(Ambient Wet Storage)、室溫干藏組Da(Ambient Dry Storage)及冷卻干藏組Dc(Chilled Dry Storage),具體貯藏方式如表1所示。原料組為分選后立即取樣;室溫濕藏組為分選后的蛤仔放置于鹽濃度為2.7 mg/L的海水中凈化48 h后,進行取樣,期間于24 h時進行一次換水;室溫干藏組和冷卻干藏組是將蛤仔放置于浸濕海水的毛巾上,同時蓋上一條同樣處理的毛巾,分別于室溫和4 ℃層析柜放置48 h后進行取樣。本試驗原料選取的是剛剛采捕上岸的菲律賓蛤仔,處于狀態較好的時期,劉慧慧等[8]對菲律賓蛤仔保藏的研究中發現,濕藏暫養48 h后,蛤仔的存活率明顯下降,為了更貼近產品的加工利用,所以本實驗選擇48 h貯藏期。

活品貯藏中的菲律賓蛤仔采樣后直接進行處理,手工將殼、軟體組織以及外套膜液分離;外套膜液通過雙層紗布過濾收集,并分裝到50 mL離心管中,隨即置于-40 ℃保藏;全部軟體組織立即勻漿成肉糜,并在干冰速凍后于-40 ℃保藏。

1.2.2 一般化學組成測定 所用原料為各個處理組在-40 ℃保藏的蛤仔外套膜液及經過干冰速凍后的軟體組織勻漿。以凈化后的樣品即室溫濕藏組為例,對菲律賓蛤仔的外套膜液及軟體勻漿進行一般化學組成的測定。樣品經4 ℃解凍后直接進行一般化學組成的測定,采用國標提供的方法測定水分(GB 5009.3-2016第一法 直接干燥法)、灰分(GB 5009.4-2016 第一法 食品中總灰分的測定)、粗蛋白質(GB 5009.5-2-16 第一法 凱氏定氮法)、粗脂肪(GB 5009.6-2016第一法 索氏抽提法)和總糖(GB/T 9695.31-2008第一法 分光光度法),并進行三次重復實驗。

1.2.3 蛋白質含量測定 采用雙縮脲比色法[11]進行蛋白含量的測定。雙縮脲標準曲線采用牛血清蛋白為標準蛋白,將標準蛋白稀釋至蛋白濃度為2、4、6、8、10 mg/mL,以稀釋蛋白∶雙縮脲為1∶4的比例混合均勻,同時進行3組平行實驗,室溫放置30 min后用紫外可見分光光度計于540 nm下測吸光度值,可得出采用紫外可見分光光度計測定,蛋白濃度的標曲為y=0.0448x,R2=0.9998,可以較為精確地測定蛋白濃度。

將各個處理組在-40 ℃保藏的外套膜液樣品在4 ℃下解凍后均質(10000 r/min,30 s)三次,采用雙縮脲法比色法,根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.4 含氮物分離 采用熱水浸提法進行分離。將各個處理組在-40 ℃保藏的外套膜液樣品在4 ℃下解凍后,于沸水浴中均勻加熱1 min,使蛋白質受熱變性,冷卻后離心(12000×g,10 min),上清液為非蛋白態氮抽提物用于游離氨基酸分析,沉淀物則為蛋白態氮,用于氨基酸組成分析[12]。

1.2.5 游離氨基酸測定 將抽提物與10% TCA(三氯乙酸)按體積比1∶1混勻,離心(10000×g,10 min),用3% TCA稀釋樣品,吸取上清通過0.45 μm的(水系)針孔過濾膜,濾液采用全自動氨基酸分析儀進行游離氨基酸的測定[13]。

1.2.6 氨基酸組成測定 采用酸水解法(GB 5009.124-2016)測定樣品中氨基酸含量。取0.5 g經熱水浸提后的沉淀物于水解管中,加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl、2滴苯酚,-20 ℃放置5 min,取出后吹入氮氣封瓶,于110 ℃放置24 h,冷卻后過濾,濾液定容至50 mL,蒸發除去鹽酸,用0.02 mol/L HCl稀釋樣品,通過0.45 μm的(水系)針孔過濾膜,濾液采用全自動氨基酸分析儀進行游離氨基酸的測定。

1.3 數據分析

采用SPSS軟件進行單因素方差分析,顯著性水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 菲律賓蛤仔外套膜液的一般化學組成特點

以室溫濕藏組為例,對菲律賓蛤仔的軟體組織和外套膜液的一般化學組成進行了分析對比。結果如表2所示,軟體組織水分含量為81.14 g/100 g,外套膜液為95.70 g/100 g。從干物質組分來看,軟體組織的主要成分為粗蛋白55.28 g/100 g,外套膜液主要成分則為灰分69.41 g/100 g,而軟體組織的灰分為13.65 g/100 g;外套膜液的粗蛋白雖然明顯低于軟體組織,但也高達15.82 g/100 g;此外,軟體組織的粗脂肪含量高于外套膜液,分別為6.07 g/100 g及3.19 g/100 g;值得關注的是,軟體組織與外套膜液的總糖含量差異不大,分別為15.84 g/100 g及15.11 g/100 g。外套膜液的高灰分含量主要有兩個原因,一是外套膜液中的無機鹽離子成分,另一方面,則由于殘留在外套膜液中的泥沙成分所致。

表2 菲律賓蛤仔軟體組織與外套膜液一般化學組成分析Table 2 Proximate compositions in soft body and mantle cavity fluid of Ruditapes philippinarum

分析結果還發現,菲律賓蛤仔外套膜液抽提氮含量達0.47 g/100 g,占外套膜液總氮含量即粗蛋白質含量的近70%;相比之下,根據研究報道,菲律賓蛤仔的軟體組織的非蛋白氮含量則不到總含氮量的30%[10]。菲律賓蛤仔的外套膜液中含有豐富的以抽提氮為主的蛋白質和碳水化合物,由此,進一步對活品貯藏方法及貯藏過程中外套膜液含氮物和總糖含量進行分析比較。

2.2 活品貯藏對外套膜液含氮物及總糖的影響

2.2.1 外套膜液抽提氮原料組及室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組的蛤仔外套膜液的抽提氮變化分布 如圖1所示。從圖1中可以看出,原料蛤仔的外套膜液抽提氮含量顯著低于貯藏組(p<0.05),在經過貯藏之后含氮量均有所升高;冷卻干藏組含氮量顯著高于室溫下的濕藏及干藏(p<0.05)。

圖1 活品貯藏48 h后的外套膜液抽提氮含量(濕基)Fig.1 Contents of extractive nitrogenin mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)注：不同字母表示組別間差異顯著(n=3，p<0.05)。圖2、圖3同。

此外,雙縮脲蛋白含量分析結果呈現相同趨勢(圖2)。原料組蛋白含量最低,外套膜液中僅為4.87 mg/mL,在經過貯藏之后蛋白濃度均顯著增高(p<0.05),其中變化最為明顯的是冷卻干藏組,濃度高達11.37 mg/mL,幾乎為原料組的三倍,室溫濕藏組和室溫干藏組相比原料組也有所升高,蛋白濃度分別為6.81和8.69 mg/mL。總體來看,在不同的貯藏條件下,原料組蛋白質含量顯著低于貯藏組(p<0.05),且冷卻組的蛋白質含量顯著高于室溫下的干藏組和濕藏組(p<0.05)。雙縮脲法測蛋白濃度具有一定的局限性,因此,雙縮脲法對外套膜液進行的蛋白含量測定只能粗略的顯示出蛋白含量變化的趨勢,而不用于具體分析。

圖2 活品貯藏48 h后的外套膜液蛋白含量(濕基)Fig.2 Contents of protein in mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)

2.2.2 外套膜液總糖分布 原料組及室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組的外套膜液總糖含量分析結果如圖3所示。總體上來看,原料組的總糖含量最低,但與室溫濕藏組相比,并未出現顯著差異(p>0.05);在經過干藏處理之后,總糖含量均顯著升高(p<0.05),而冷卻干藏處理的總糖含量顯著高于室溫干藏處理(p<0.05)。外套膜液的總糖含量與抽提氮及蛋白態氮的含量測試結果顯示出相似的趨勢。

與原料組相比,各處理組的外套膜液抽提氮、蛋白質以及總糖的含量(圖1～圖3)均有所升高,

圖3 活品貯藏48 h后的外套膜液總糖含量(濕基)Fig.3 Contents of carbohydrates in mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)

分析原因,可能是為活品狀態的蛤仔外套膜液的含量因蛤仔生命代謝發生了變化,即外套膜液水分降低,導致化學組成成分的不同程度濃縮。進一步分析發現,干藏處置下的各個組分高于濕藏處置,冷卻條件高于常溫條件,由此來看,冷卻干藏更促進外套膜液水分流失。

2.3 活品貯藏對外套膜液氨基酸組成的影響

2.3.1 外套膜液抽提氮的游離氨基酸分布 表3為菲律賓蛤仔外套膜液抽提氮的游離氨基酸分析結果。原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組以及冷卻干藏組游離氨基酸總量依次為58.25、77.48、83.47、134.14 mg/100 mL。各組間均存在差異,其中冷卻干藏組含量最高,其次為室溫干藏組和室溫濕藏組,原料組最低。

表3 外套膜液抽提氮游離氨基酸含量(mg/100 mL抽提物)Table 3 Contents of free amino acids in mantle cavity fluid extracts(mg/100 mL extracts)

在貽貝的蒸煮液研究中發現其呈味物質豐富[14],在蛤仔中氨基酸有效呈味物質為甘氨酸、L-谷氨酸和L-精氨酸,甘氨酸呈現甜味,谷氨酸可以提供鮮味,精氨酸被認為是多數無脊椎動物的呈味成分,可以提高風味[15]。在表3中可以發現,這三種氨基酸在外套膜液中的含量很高,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組及冷卻干藏組甘氨酸含量分別為19.73、20.60、25.60、40.11 mg/100 mL,谷氨酸含量為7.62、9.36、11.29、17.01 mg/100 mL,精氨酸含量為8.06、10.85、11.58、20.20 mg/100 mL,在不同貯藏條件下,三種氨基酸總含量均占到總游離氨基酸的50%以上。除了這三種氨基酸外,丙氨酸的含量也相對較高,分別為7.86、11.30、12.25、17.08 mg/100 mL,丙氨酸也是一種常見的能使人感到甜味的氨基酸,因此,菲律賓蛤仔的外套膜液在開發海鮮調味料方面極具開發潛力[16]。

此外,除了分析方法所限(色氨酸),其它7種必需氨基酸包括蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸均有檢測,其中賴氨酸含量最高,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組及冷卻干藏組賴氨酸含量分別為3.40、6.83、5.85、11.99 mg/100 mL。從表3可知,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組必需氨基酸占總游離氨基酸的比值,在不同活品狀態的蛤仔之間存在一定差異,換言之,貯藏方式和條件對外套膜液的化學組成特性有一定影響。此外,游離氨基酸分析表明,菲律賓蛤仔外套膜液不僅具有調鮮功能,而且還可以提供人體所需的必需氨基酸,尤其是賴氨酸。

2.3.2 外套膜液蛋白氮的氨基酸組成 表4為菲律賓蛤仔外套膜液蛋白態氮的氨基酸組成分析結果。由表4可知,室溫濕藏組及冷卻干藏組整體無顯著差異(p>0.05),且這兩個處理組均顯著高于原料組及室溫干藏組(p<0.05);各組必需氨基酸含量占總氨基酸的百分比結果表明,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組以及冷卻干藏組比值為25.54%、37.46%、27.13%、28.84%。對原料組及不同貯藏組必需氨基酸含量進行比較,發現室溫濕藏組的必需氨基酸含量占總氨基酸的比值達到37.46%,而其他三組均未達到30%以上。室溫濕藏組高于其它組的原因,與活品生命代謝關系不大,可能是由于生物樣本自身的個體差異所致。

表4 外套膜液蛋白態氮氨基酸組成(g/100 g沉淀物)Table 4 Composition of amino acids in protein nitrogen of mantle cavity fluid(g/100 g precipitate)

3 結論

菲律賓蛤仔外套膜液中水分含量高達95.70 g/100 g;干物質中主要由灰分、粗蛋白及總糖組成,含量分別為69.41、15.82及15.11 g/100 g;含氮物中70%左右為非蛋白態即抽提氮。與原料組相比,三個貯藏組的總氮、抽提氮、游離氨基酸和總糖有明顯升高趨勢,生命代謝及水分流失是產生波動的主要原因,且冷卻干藏組受到的影響最顯著(p<0.05)。各個處理組氨基酸含量雖然存在明顯差異,其中有效呈味氨基酸(甘氨酸、谷氨酸和精氨酸)占總游離氨基酸的50%以上,呈甜味的氨基酸丙氨酸含量也較高;蛋白態氮和抽提氮中均檢測到了人體所需要的必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸),而且在蛋白態氮中含量較高,其中賴氨酸含量最高。菲律賓蛤仔外套膜液的美味和營養優勢,為開發高附加值鮮味劑提供參考。本文僅對菲律賓蛤仔氨基酸呈味物質進行了分析,其他呈味物質如無機鹽、多肽、核酸、有機堿和糖等還有待進一步研究。