斜葉黃檀精油功能活性

廖良坤,張蘇慧,周 偉,*,李積華,魏曉奕,崔麗虹,袁 源,王綏鑫,萬明正

(1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所,廣東湛江 524001； 2.農業部熱帶作物產品加工重點實驗室,廣東湛江 524001； 3.華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070； 4.海南景和農業開發有限公司,海南海口 570100)

斜葉黃檀(Dalbergiapinnata(Lour.)prain.)主要產于廣西、海南等地,可用于制作佛珠、手串以及精制精油等,屬于降真香中的一個屬[1]。在《本草綱目》[2]中有關于斜葉黃檀資料的記載,可以被用作熏香用的香料,也可以在戰場上被用于治療跌打損傷和刀傷等藥材使用[3],因此斜葉黃檀兼具香藥兩方面的作用。斜葉黃檀作為降真香中的一種香料,目前有關斜葉黃檀的資料較少,多數曾將其降真香誤認為降香,直到張丹雁[3]將其利用基因鑒定技術才得以鑒別。

精油是由多種成分所組成的混合物,目前關于植物精油功能活性的研究主要有抗氧化、抑菌、抗炎以及對酶活性的抑制等[1,4-14],其中研究最多的為抗氧化和抑菌。Sacchetti G等[15]比較了十一種不同精油的抗氧化活性,Saima Siddique等[16]通過瓊脂擴散法和微量稀釋法研究白千層木精油對食源性病菌的抑菌和殺菌作用。由于植物精油殘留毒性和副作用小,因此近年來對不同精油的抑菌研究較多[17-20]。茶樹精油被開發為藥物和保健品,也被用作防腐劑和消毒劑等[21]。植物精油已有的抗氧化、抑菌等生物活性使得其備受關注,其應用領域也越來越廣泛。

然而,目前關于斜葉黃檀的資料主要集中在品種鑒定及成分分析方面,而對斜葉黃檀精油功能活性方面的研究較少,趙維波等[22]采取水蒸氣蒸餾法提取斜葉黃檀中的精油并研究其抗氧化活性。本文主要通過超臨界CO2提取斜葉黃檀精油,測定其中多酚、黃酮的含量,并測定其體外抗氧化、抑菌能力以及抑制黑色素的形成能力,為斜葉黃檀精油的深入研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斜葉黃檀精油 超臨界CO2萃取得到[23];沒食子酸標準品(純度:HPLC≥98%)、蘆丁標準品(純度UV≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;福林酚、DPPH、ABTS 美國Sigma公司;亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、酪氨酸酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;L-酪氨酸 上海麥克林生化科技有限公司;熊果苷(化妝品級) 青島優索化學科技有限公司;硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、磷酸鈉、鉬酸銨、三氯化鐵、硫酸、碳酸鈉、二叔丁基對甲苯(BHT) 均為國產分析純;測試菌種包括2株革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、化膿性鏈球菌(StreptococcusATCC 19615);3株革蘭氏陰性菌,大腸桿菌(EscherichiacoliCMCC(B)44103)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimuriumATCC 14028);1株真菌,白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231) 其中大腸桿菌來源于廣東環凱微生物科技有限公司,其他五株菌均來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心;牛肉粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、酵母粉、葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化鈉、麥芽糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、胰蛋白胨 國產生化級。

UV-1780紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;Shimadzu QP2010-Plus氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司;全自動高壓蒸汽滅菌器、pH計、離心機、恒溫振蕩培養箱 中國熱帶農業科學院農產品加工研究所。

1.2 實驗方法

1.2.2 多酚含量的測定 參照國標法測定多酚含量[24]。具體操作如下:配制濃度為1 mg/mL的沒食子酸溶液,分別取配制好的沒食子酸溶液0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容。分別取上述稀釋后的沒食子酸溶液各2 mL于50 mL容量瓶,再依次加10 mL 10%福林酚試劑,8 mL 7% Na2CO3溶液,室溫下放置1 h,用蒸餾水定容至刻度線后于765 nm處測定吸光度值。以不同濃度沒食子酸為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

樣品處理:將待測樣品用無水乙醇適度稀釋后取2 mL于50 mL容量瓶中,同樣加10 mL 10%福林酚試劑,8 mL 7% Na2CO3溶液,室溫下放置1 h后,用蒸餾水定容后于765 nm處測定吸光度值。根據標準曲線,得到多酚含量。

1.2.3 黃酮含量的測定 對Behnaz Tohidi等[25]方法稍作修改。具體操作方法如下:配制濃度為0.24 mg/mL的蘆丁溶液,分別取0.24 mg/mL蘆丁溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸餾水定容,搖勻后在室溫下放置15 min后于波長為510 nm處測定吸光度值,以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

樣品處理:取適度稀釋后的待測樣品于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸餾水定容,搖勻后在室溫放置15 min后于波長為510 nm處測定吸光度值。根據標準曲線,得到黃酮含量。

1.2.4 抗氧化活性的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考Hu等[26]的方法,操作如下:配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,貯存于棕色瓶中備用。用無水乙醇將精油配制成不同濃度(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),取不同濃度精油待測液2 mL,加入DPPH乙醇溶液2 mL,混合均勻,放置室溫下于暗處反應30 min,測定517 nm處的吸光度值A1;另取試管加入2 mL乙醇溶液和2 mL DPPH乙醇溶液,測定517 nm處吸光度A2;取不同濃度待測液2 mL,各加入2 mL乙醇溶液,測定517 nm處吸光度A0;平行3次試驗取平均值。按上述條件,用不同濃度BHT(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL)做陽性對照。按公式計算DPPH自由基清除率。

關小美1986年6月出生于洛陽市某縣，家境富裕。2008年從洛陽市某大學畢業后，被安排到某企業做行政工作，單位還給她分了一間單身宿舍，工作輕松又體面。

式(1)

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力的測定 參考Miller等[27]的方法,ABTS待用液的配制如下:分別配制7 mmol/L的ABTS溶液和2.4 mmol/L過硫酸鉀溶液,將兩者等體積混合均勻后倒進棕色的玻璃瓶里,室溫下暗處反應12～16 h形成ABTS待用液。用無水乙醇稀釋到在734 nm處吸光度值為0.7±0.02。ABTS清除能力測定的具體操作為:配制不同濃度的精油待測樣品(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),分別取不同濃度待測樣品2 mL,在反應體系中加入4 mL ABTS溶液,在734 nm處測定放于暗處反應20 min后的吸光度值AA,同時用水代替樣品做空白對照的吸光度值為Ac。用同濃度的BHT做陽性對照。

ABTS自由基清除率(%)=[(Ac-AA)/Ac]×100

式(2)

1.2.4.3 總還原力的測定 參考李順峰等[28]方法,將待測的不同濃度精油(0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL)各吸取1 mL于試管中,分別加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=6.6 0.2 mol/L)、1.5 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6),混勻后于50 ℃恒溫水浴中反應20 min,冷卻至室溫后各加入1.5 mL質量分數為10%的TCA,充分混勻后在離心機中以4000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL、加入0.5 mL新配制的質量分數為0.1%的三氯化鐵溶液和2 mL蒸餾水,在常溫下充分混勻后在波長為700 nm處測定各個試管中樣品的吸光度值。用同濃度的BHT做陽性對照。

1.2.4.4 總抗氧化能力的測定 采用磷鉬絡合法測定精油的總抗氧化能力[29]。將待測精油用無水乙醇溶解后配成不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),吸取1 mL于試管中,依次加入已配制好的濃度分別為0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L的鉬酸銨各1 mL,在常溫下充分搖蕩均勻后在95 ℃的水浴鍋中水浴1.5 h,后取出冷卻至室溫,于695 nm處測定吸光度值,陽性對照BHT做同樣處理。

1.2.5 抑菌活性的測定 該實驗選取兩株革蘭氏陽性菌,三株革蘭氏陰性菌和一株真菌作為待測菌株,測定斜葉黃檀精油對六株菌的抑菌圈直徑以及最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。具體操作如下:

1.2.5.1 抑菌圈的測定 參考劉曉生等[30]法,并加以修改。具體操作如下:將培養至對數生長期的菌原液取200 μL在已凝固的固體培養基上,涂布均勻后在上方均勻對稱放置三張濾紙片(直徑為6 mm),取待測精油5 μL加在濾紙片上,在37 ℃下培養24 h,通過測量抑菌區域的直徑判斷精油的抑菌活性,每次實驗重復三次。抑菌圈實驗測定標準為:抑菌圈大于20 mm,極敏;15～20 mm,高敏;10～15 mm,中敏;7～10 mm,低敏;小于7 mm,不敏感。

1.2.5.2 MIC和MBC的測定 用肉湯稀釋法(二倍稀釋法)測定精油的MIC和MBC。用吐溫80將精油配成不同濃度(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μL/mL),在各試管中依次加入8.9 mL培養基、0.1 mL菌懸液、1 mL不同濃度精油,最終精油濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 μL/mL,24 h后觀察細菌生長情況,無明顯渾濁的最小濃度為MIC,取無明顯菌落生長的試管,挑取后平板劃線,24 h后仍無菌落生長的為MBC。

1.2.6 抑制酪氨酸酶活性的測定 參考Baurin N等[31]方法并做修改,具體操作如下:依次配制如下試劑:磷酸鹽緩沖液(pH=6.8,0.2 mol/L磷酸二氫鈉,0.2 mol/L磷酸氫二鈉)、L-酪氨酸溶液(1.5 mmol/L)、酪氨酸酶溶液(酶活:50 U/mL)、樣品(用甲醇配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL),用同濃度的熊果苷做陽性對照。

在反應體系中依次按如表1加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度待測樣品、酪氨酸酶,30 ℃水浴10 min后,向反應體系中加入L-酪氨酸溶液,反應20 min后在475 nm處吸光度值。

表1 抑制酪氨酸酶活性實驗各物質添加順序Table 1 The order of adding substance tyrosinase activity inhibition experiment

抑制率(%)=[(A-B)/A]×100

式(3)

式中：A-標準對照吸光度值;B-待測物吸光度值。

1.3 數據處理

化合物采用峰面積歸一化法進行計算,實驗結果以平均值±標準偏差(SD)表示,以Origin 8.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 精油中揮發性成分分析

表2為經超臨界CO2提取得到的精油中主要成分,其中欖香素所占比例高達75.54%,威士忌內酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚所占百分含量分別為0.47%、1.27%和2.35%。而趙維波等[22]采用水蒸氣蒸餾法提取得到的揮發油中的欖香素、威士忌內酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚的含量分別為:89.74%、0.41%、0%和2.67%。此外后者揮發油類還含有水楊醛、芳樟醇等成分,在本實驗中并未得到此類揮發性成分,可能是原料來源不同或者儀器參數等的差別,使得提取得到的精油揮發性成分存在差異性。在精油中所檢測到的成分中,欖香素主要有較強的催眠作用、抗蚊殺蟲及抗真菌、抗肺炎等作用[32],甲基丁香酚具有降壓、抗氧化、抑菌等作用[33],4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚具有抑制脂質過氧化的作用,以及清除自由基等抗氧化作用[34],威士忌內酯具有較強的抑菌、抗炎及抗氧化等作用,可用于糖果、餅干等各類食品的食用香料[22]。鑒于主要成分本身具有的特殊功能活性,故而對精油的總體功能活性進行評價。

表2 斜葉黃檀精油揮發性成分分析Table 2 Analysis of volatile constituents of essential oil from Dalbergia pinnata

2.2 精油中多酚含量測定結果

經測定多酚標曲為y=0.0846x+0.0194,R2=0.9993,斜葉黃檀精油中多酚含量為95.52 μg沒食子酸當量/mg精油,含量為9.552%。與其他植物精油相比,含量相對較高,周海旭[35]在用無水乙醇作為提取溶劑且在最優條件下提取樟樹中的多酚,得到的多酚得率為5.41%,以及Abdelwahab S I等[36]通過水蒸氣蒸餾法提取得到的樟樹中精油的多酚含量為5.04%。多酚含量均小于本實驗提取得到的多酚含量。

2.3 精油中黃酮含量測定結果

繪制的標準曲線為y=12.084x-0.0124,R2=0.9993,斜葉黃檀中黃酮含量為0.0913 mg蘆丁/mg精油,即黃酮含量百分比為9.13%。與其他植物精油相比,含量也存在差異性,經查閱相關文獻麝香草中T.fallax中黃酮含量為8.14%,T.vulgaris中黃酮含量為8.55%[37],要低于本實驗所提取得到的精油中的黃酮含量。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 精油對DPPH自由基清除能力的影響 斜葉黃檀精油對DPPH自由基清除能力的影響見圖1。隨著精油濃度的升高,其對DPPH自由基的清除能力也逐漸增大,斜葉黃檀精油與DPPH自由基清除能力呈現出較好的量效關系。本研究中精油濃度為0.18 mg/mL時,清除率為70%左右,而趙維波等[22]通過水蒸氣蒸餾提取得到的揮發油在清除率為70%左右時,其精油濃度為16 mg/mL。說明斜葉黃檀精油對DPPH自由基具有較強的清除能力,提取方法的不同使得精油對DPPH自由基的清除能力存在差異。此外精油與陽性對照BHT相比,其DPPH自由基清除能力弱于陽性對照,且與陽性對照存在較大差異,隨著濃度的升高,差異逐漸減小。

圖1 斜葉黃檀精油對DPPH自由基清除能力的影響Fig.1 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on DPPH radical

2.4.2 精油對ABTS自由基清除能力的影響 圖2為斜葉黃檀精油對ABTS自由基清除能力的影響。斜葉黃檀精油對ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強,呈現較好的量效關系。在相同濃度下,其清除能力要弱于陽性對照BHT。在濃度為0.18 mg/mL時,對ABTS自由基的清除能力達80%以上,可見其對ABTS自由基的清除能力較強。

圖2 斜葉黃檀精油對ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on ABTS radical

2.4.3 精油對總還原力的影響 圖3為斜葉黃檀精油對總還原力的影響,斜葉黃檀精油的總還原力值與濃度關系密切,隨著濃度的增高,總還原力值也隨之增加,呈現出良好的正相關性。但與陽性對照相比,仍較低,陽性對照在濃度為0.12 mg/mL時總還原力值就達0.8以上,而斜葉黃檀精油僅有0.4左右。

圖3 斜葉黃檀精油對總還原能力的影響Fig.3 Effect of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on the total reducing power

2.4.4 精油對總抗氧化能力的影響 圖4為斜葉黃檀精油對總抗氧化能力的影響,與陽性對照BHT對比,總抗氧化能力相對較弱,在精油濃度為1 mg/mL為總抗氧化值達到0.4,而同濃度的陽性對照BHT的總抗氧化值達到0.7以上。總抗氧化能力隨著精油濃度的增加而呈現較好的正相關性。

圖4 斜葉黃檀精油對總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of the total antioxidant capacity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

2.5 精油的抑菌結果

表3為斜葉黃檀精油對不同測試菌的抑菌能力大小,從表3中抑菌直徑結果可以看出,斜葉黃檀精油對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌以及白色念珠菌均為中敏程度。但對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌三株革蘭氏陰性菌無明顯的抑菌效果。故而可以判斷斜葉黃檀精油具有抑制革蘭氏陽性菌和真菌的活性。

表3 斜葉黃檀精油的抑菌結果Table 3 The results of bacteriostasia of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

針對斜葉黃檀精油具有的抑制革蘭氏陽性菌和真菌的作用,測定其MIC和MBC,值越小表明抑菌性越強,可見斜葉黃檀精油對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值最小,對其抑菌性最為明顯。對化膿性鏈球菌的MIC和MBC值次之,而金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌均是存在于人體表面的細菌,因精油具有明顯的抑菌效果，可以擴大精油的應用范圍。

2.6 精油對酪氨酸酶抑制率的影響

圖5為精油和陽性對照熊果苷對酪氨酸酶的抑制率結果。隨著精油濃度的升高,精油對酪氨酸酶的抑制率存在著正相關性。斜葉黃檀精油與陽性對照熊果苷均有強的抑制酪氨酸酶活性,進而抑制黑色素的形成,且精油對酪氨酸酶的抑制活性強于陽性對照熊果苷。間接證明了斜葉黃檀精油具有抑制黑色素形成的能力。故而為斜葉黃檀精油的廣泛應用提供理論依據。

圖5 斜葉黃檀精油抑制酪氨酸酶活性Fig.5 The inhibition activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on tyrosinase

3 結論

本文較為系統的研究了斜葉黃檀精油中的多酚、黃酮含量以及精油的抗氧化、抑菌和抑制黑色素形成能力的功能活性,結果證明該精油具有較好的清除DPPH和ABTS自由基能力,較強的總還原力以及總抗氧化能力,綜合證明該精油具有較強的抗氧化活性;對革蘭氏陽性菌(G+,主要是金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌)以及真菌具有較好的抑制活性,以及具有抑制酪氨酸酶活性的功效,從而抑制黑色素的形成。精油是由多種成分組成的復雜體系,其具有多方面的功能活性是多種復雜成分共同作用的結果,本研究結果為精油的深入研究以及在應用方面提供一定的理論依據,也為開發更多產品提供一定的參考價值。