脂肪酶預處理及雞油添加 對蠶蛹呈味基料風味的影響

陳 政,穆利霞,廖森泰,*,鄒宇曉

(1.華中農業(yè)大學食品科技學院,湖北武漢 430070; 2.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所,廣東廣州 510610)

蠶蛹是蠶蛾科家蠶蛾的蛹,也是蠶繭繅絲后的主要副產物。長期以來,我國人民一直把它當作滋補強生,健脾和胃,增長肌肉,祛風除濕的藥食佳品[1]。蠶蛹富含蛋白質,其干物質粗蛋白含量在52%以上,蛋白質中含有18種氨基酸,所含氨基酸配比均衡性好(必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.7∶1),且必需氨基酸接近或超過總氨基酸的40%[2],符合FAO/WHO所建議的理想氨基酸模式(必需氨基酸占總氨基酸含量的40%,且必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.6∶1),是一種優(yōu)質的昆蟲類蛋白資源,也是受到衛(wèi)生部認可并批準的“作為普通食品管理的食品新資源名單”中唯一的昆蟲類食品[3]。

目前,市場上的蠶蛹類相關產品主要包括即食蠶蛹、蠶蛹油、蠶蛹蛋白粉、蠶蛹醬油、氨基酸口服液等,但這些產品往往技術含量不高,無顯著的保健功能或者缺少產品的更新?lián)Q代,因此并沒能在市場上占得一席之地,從而造成蠶蛹蛋白資源不能得到廣泛利用[4]。科研人員對蠶蛹等昆蟲類蛋白的研究主要集中在對其營養(yǎng)功能的分析和討論,或基于蛋白質的物理或者化學改性、活性肽的提取、水解氨基酸的制備,及蠶蛹蛋白粉的蠶蛹多肽的制備[5]。鄭仕遠[6]利用蛋白改性的原理,研究蠶蛹蛋白的酶解工藝,發(fā)現經前處理(脫脂、脫纖維)和改性后的蠶蛹蛋白的酶解效率得到了改善。肖燕平等[7]發(fā)現蠶蛹蛋白酶解產物具有很強的體外抗氧化活性。昌友權等[8]指出蠶蛹蛋白對體細胞有顯著的免疫作用。宋蓮軍等[9]將脫脂后的蠶蛹進行水解,得到的酶解產物水解度達23.75%,水解液中18種氨基酸的濃度達15.64 g/L。魯珍等[10]研究發(fā)現,蠶蛹來源豐富,蛋白質和鮮甜味氨基酸含量高,是制備呈味基料的優(yōu)質原料,利用蠶蛹制備呈味基料可以大大提高蠶蛹的利用價值。蠶蛹雖然蛋白含量高,但蠶蛹因其蛋白生產技術的不足、腥臭味殘留及市場推廣等問題,限制了它在食品、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應用。

針對蠶蛹制作的美拉德反應產物存在風味單一,香氣不夠濃郁,苦味和腥臭味較重等問題,本研究分別以新鮮削繭桑蠶蛹和柞蠶蛹為原料,通過脂肪酶的預處理和雞油的添加對桑蠶蛹和柞蠶蛹進行處理,通過酶解和美拉德反應制備呈味基料,以酶解產物的水解度、呈味基料的氨基酸組成、感官風味等為評價指標,旨在探討不同處理對蠶蛹制備呈味基料風味的綜合影響,為蠶蛹的呈味基料的制備和高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮剝繭桑蠶蛹 產地廣西,呈土黃色,身長2～4 cm,單個重量2～4 g,鮮重蛋白含量12.83%;新鮮剝繭柞蠶蛹 產地黑龍江,呈黑褐色,身長4～6 cm,單個重量12～16 g,鮮重蛋白含量16.36%;雞油 購于廣州黃沙海鮮市場;Novozym 37071(20.35×104U/g)、風味蛋白酶(1.88×104U/g) 諾維信(中國)生物技術有限公司;脂肪酶(3.00×104U/g) 廣州市齊云生物技術有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素、D-木糖 上海伯奧生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

K8400凱氏定氮儀 瑞典FOSS 公司;PB-10 pH計 瑞士Mettler Toledo公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;Biofuge Stratos Sorvall離心機 美國Thermo公司;L-8900 氨基酸分析儀 日本HITACHI公司;6890 N/5975氣質聯(lián)用儀 美國Agilent公司;75 μm(Carboxen/PDMS)萃取頭 美國Agilent公司;Supelco手動固相微萃取進樣手柄 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶蛹處理方式 漂燙滅酶:將桑蠶蛹和柞蠶蛹分別用沸水浴漂燙2 min;用榨汁機將滅酶后的蠶蛹打成漿,測定其蛋白含量:參照GB5009.5-2016。

1.2.2 脂肪酶的預處理 測得桑蠶蛹蛋白含量后,分別用蒸餾水將柞蠶蛹底物蛋白濃度調至10%(m/v),參照吳婕[11]的方法并加以改進,于50 ℃水浴中攪拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調節(jié)至8.0,一杯加入占溶液質量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作為空白對照,控制溫度為45 ℃,水解2 h。

測得柞蠶蛹蛋白含量后,用蒸餾水將柞蠶蛹底物蛋白濃度調至10%(m/v),于50 ℃水浴中攪拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調節(jié)至8.0,一杯加入占溶液質量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作為空白對照,控制溫度為45 ℃,水解2 h。

1.2.3 蠶蛹蛋白酶解液的制備 待上述4組樣品經脂肪酶水解2 h后,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調節(jié)至8.0,加入占樣品蛋白質量5.4%的風味蛋白酶、2.3%的Novozym 37071,控制溫度為50 ℃,開始酶解,6 h后于沸水浴中滅酶10 min,過濾得蠶蛹酶解液。

1.2.4 水解度的測定 水解度(DH)測定:pH-stat法[12]。

1.2.5 雞油的添加及美拉德反應產物的制備 將上述4組樣品各均分2份,一份添加2%的雞油,另一份不添加作為空白對照,得到八組樣品:蠶蛹不加脂肪酶不加雞油(SC),桑蠶酶不加脂肪酶加雞油(COSC),桑蠶蛹脂肪酶預處理不加雞油(LSC),桑蠶蛹脂肪酶預處理加雞油(LCOSC),柞蠶蛹不加脂肪酶不加雞油(OSC),柞蠶蛹不加脂肪酶加雞油(COOSC),柞蠶蛹脂肪酶預處理不加雞油(LOSC),柞蠶蛹脂肪酶預處理加雞油(LCOOSC)。參照魯珍等[10]的方法并稍作調整進行美拉德反應:酶解液30 mL,D-木糖0.75 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.6 g,硫胺素0.45 g,溫度110 ℃,時間60 min。

1.2.6 氨基酸的測定 分別檢測八組樣品的總氨基酸組成及含量,方法參照GB 5009.124-2016。

1.2.7 感官評價 參照吳婕等[11]的方法,對樣品從色澤、組織形態(tài)、氣味和滋味四個方面綜合評定并打分。本次實驗采用100分制,每項指標25分,每個樣品評分數據去掉最高和最低評分后取平均值。感官評定小組由10位品評員組成。感官評價標準見表1。

表1 蠶蛹呈味肽感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criterion of silkworm chrysalis

1.2.8 風味物質成分的提取 采用頂空固相微萃取(HS-SPME)的方法,其中萃取頭在使用前要老化,以確保脫去其可能吸附的揮發(fā)性成分。老化后的萃取頭在GC-MS上檢測略有極少量的萃取頭固有雜質峰出現,在樣品質譜庫檢索的時候去除,不計入最終結果。

固相微萃取的操作步驟:分別量取4 mL樣品于頂空萃取瓶中,應用75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取頭(Supelco,Bellefone,PA,USA)在50 ℃條件下萃取30 min富集揮發(fā)性化合物,然后用氣相色譜來分析纖維頭上的揮發(fā)性化合物[13]。

1.2.9 風味物質鑒定 色譜條件(GC):J&W 122-7032毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);模式:恒定流量;加熱器:250 ℃;壓力13.06 psi;分流流量:23.3 mL·min-1;升溫程序:150 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至230 ℃,保持10 min。檢測器溫度:250 ℃;進樣量:0.2 μL;溶劑推遲:2 min;載氣(He)流量:40 mL/min;分流比20∶1。

質譜條件(MS):電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度275 ℃;離子源溫度200 ℃;母離子m/z 285;激活電壓1.5 V;質量掃描范圍m/z 30～450。檢索譜庫為NIST。

1.2.10 數據處理與統(tǒng)計分析 文中每組實驗結果均重復3次(感官評價除外),結果以“平均值±標準差”表示,運用Microsoft Excel 2013對實驗數據進行整理與制表,Origin 7.5軟件(OriginLab公司)作圖,SPSS17.0軟件(IBM公司)進行顯著性分析,p<0.05為顯著。揮發(fā)性風味物質成分試驗數據處理由GC-MS分析軟件系統(tǒng)完成,通過檢索NIST11質譜庫進行定性,未知化合物經計算機檢索的同時與標準圖譜對照相匹配,匹配度大于80(最大值為100)的作為鑒定結果。物質的相對百分含量按峰面積歸一化法計算。

2 結果與分析

2.1 不同處理對蠶蛹酶解液美拉德反應產物感官評價指標的影響

美拉德反應是還原糖和氨基酸、肽或蛋白質之間的非酶反應,也是形成大多數風味化合物的主要途徑,可以改善食品的色、香、味[14]。不同處理的美拉德反應產物的感官評價如表2所示,由表2可知,無論是桑蠶蛹還是柞蠶蛹,都是脂肪酶預處理加雞油組的風味最好,總分最高的是柞蠶蛹脂肪酶預處理加雞油(81.8)和桑蠶蛹脂肪酶預處理加雞油(79.1)。總體而言,脂肪酶預處理組與對照組相比,在組織形態(tài)和滋味方面存在顯著差異(p<0.05),在色澤和氣味方面存在顯著差異;而添加雞油組與對照組相比,在滋味方面存在顯著差異(p<0.05),在色澤、組織形態(tài)和氣味方面評分與對照組相差不大;既有脂肪酶預處理又添加雞油組與對照組相比,在色澤、組織形態(tài)、氣味和滋味四個方面都存在顯著性優(yōu)勢(p<0.05)。綜合得分情況,兩種處理組>單個處理組>空白對照組。這表明一定量的脂肪酶處理和雞油的添加都能對蠶蛹呈味肽的感官評價產生積極的影響,而兩者共同作用的效果更為明顯。

表2 不同處理的美拉德反應產物的感官評價Table 2 Sensory evaluation results of Maillard reaction products

2.2 不同處理對蠶蛹酶解液水解度的影響

水解度是反映蛋白質水解程度的一個重要指標,水解度的不同會引起酶解產物氨基酸組成的差異,從而影響風味物質的形成[15]。脂肪酶預處理與空白對照組的水解度如圖1所示,在360 min時,柞蠶蛹加酶的水解度最高(26.21%),依次為:柞蠶蛹加酶(26.21%)>柞蠶不加酶(24.22%)>桑蠶蛹加酶(23.83%)>桑蠶蛹不加酶(22.41%)。在120 min后,脂肪酶預處理組的水解度與對照組相比存在顯著性差異(p<0.05),處理組的水解度明顯大于對照組。Gustavo L L S等[16]發(fā)現,脂肪酶酶解脂肪,使得一部分與脂肪結合的蛋白質基團暴露出來,進一步酶解,使水解度增大。這表明脂肪酶的預處理有助于蠶蛹蛋白水解,使蠶蛹蛋白水解度增大。

圖1 不同處理對蠶蛹酶解液水解度的影響Fig.1 Influence of the pupa enzymatic hydrolysis with different methods

2.3 不同處理對美拉德反應氨基酸組成的影響

蛋白質在酶的水解作用下,最終變成小分子的短肽和游離氨基酸,而短肽和游離氨基酸都是參與美拉德反應的重要物質[17]。八種處理方式制備的美拉德反應產物氨基酸組成如表3所示,八種處理中LCOOSC組(柞蠶蛹脂肪酶預處理加雞油)的鮮甜味氨基酸占總鮮甜味氨基酸的比例最高(45.58%),與對照組OSC組(柞蠶蛹不加脂肪酶酶不加雞油)相比,鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高(p<0.05),這與感官評價脂肪酶處理和雞油添加能顯著提高呈味肽風味的結果相一致。類似的,第LCOSC組(桑蠶蛹脂肪酶預處理加雞油)相比第SC組(桑蠶蛹不加脂肪酶不加雞油),鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高(p<0.05)。說明脂肪酶和雞油共同作用,能使美拉德反應產物的鮮甜味氨基酸占總氨基酸比例顯著提高(p<0.05),與前面感官評價結果一致。

表3 不同處理對蠶蛹美拉德反應產物氨基酸組成的影響Table 3 Influence of the amino analysis of MRPS with different methods

2.4 不同處理對蠶蛹酶解液美拉德反應產物揮發(fā)性風味物質的影響

蠶蛹美拉德反應產物的風味物質較為復雜,種類頗多,其中最重要的呈味物質是醛、吡嗪、酮、呋喃以及其它化合物。

由脂質氧化、熱降解產生的,醛類化合物是肉香成分中的特征化合物之一[18]。8組試驗樣品鑒定出的醛類化合物中，壬醛和異戊醛含量較高,壬醛具有玫瑰和柑橘芳香,異戊醛則是亮氨酸發(fā)生Strecker降解產生的,具有巧克力香味,是咖啡、巧克力、牛奶、雞肉等食物的關鍵香氣成分之一[19]。低含量的醛可以賦予產品脂香風味。

其次,樣品檢測到的吡嗪類化合物種類也較多,主要有2-甲基吡1嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪。吡嗪類物質是美拉德反應的典型產物,其閾值低,具有堅果香、焦香和基本的烤肉香,是對肉香味形成貢獻較大的化合物[20],在檢測到的吡嗪類化合物中2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪含量較高,2,5-二甲基吡嗪具有烤香和肉香,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪具有堅果香。其中低分子肽(<500Da)是吡嗪類化合物產生的主要貢獻者。脫襯模擬處理樣品中吡嗪類物質的減少,可能是由于酶解液中肽類氨基酸的減少。Scalone GL[21]等研究發(fā)現,寡肽的存在可以顯著增加吡嗪類化合物的含量,游離氨基酸對生成吡嗪類物質則貢獻較少。

酮類及醇類化合物的呈味閾值較高,因此對風味的貢獻不大。酯類呈味閾值低,也是反應產物的主要呈味物質[22],其中乙醇酸乙酯、2-羥乙基甲酸酯及丁酸甲酯的含量較高。呋喃類化合物因其大都具有強烈的肉香及極低的香氣閾值,而幾乎存在于所有的食品香味中。不同處理樣品均檢出了2-戊基呋喃,該物質閾值低(4ppb),具有烤味、蔥香味,是動物脂質熱氧化生成的常見風味物質之一[23]。此外,還檢測出了較多的其它揮發(fā)性化合物,其中二甲基三硫具有肉香、洋蔥和蔬菜香氣,且閾值極低[24];十一烷具有雜醇氣味,含量很高,但烷烴呈味閾值較高[25],因此推測其對呈味有一定的貢獻,但對整體風味貢獻不大。

表4 桑蠶蛹美拉德反應產物主要風味成分的種類歸屬及相對含量Table 4 The kinds of classification and relative percentage of Silkworm pupa Maillard reaction product

表5 柞蠶蛹美拉德反應產物主要風味成分的種類歸屬及相對含量Table 5 The kinds of classification and relative percentage of Oak Silkworm pupa Maillard reaction product

總體而言,脂肪酶處理組與對照組相比,吡嗪類物質的種類和含量都有所增加,存在顯著性差異(p<0.05)。

雞油添加組與對照組相比,醛類和呋喃類物質的含量有所增加,存在顯著性差異(p<0.05)。而脂肪酶處理和雞油添加組與對照組相比,醛類、吡嗪類、呋喃類風味物質種類和含量都顯著性增加(p<0.05),而這三類物質都對呈味肽的風味有積極正面的影響。說明脂肪酶處理和雞油添加能使蠶蛹呈味肽的主要風味成分顯著提高(p<0.05)。

3 結論

脂肪酶預處理和雞油添加兩種處理方式均能在一定程度上改善呈味基料的感官特性,其中柞蠶蛹脂肪酶預處理加雞油處理的最終產物風味最好,評分為81.8。脂肪酶預處理和雞油添加共同作用,能使蠶蛹呈味肽中鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高。其中最高的為第8組(柞蠶蛹脂肪酶預處理加雞油),鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例為45.58%。脂肪酶處理和雞油的添加可以顯著提高蠶蛹呈味肽中醛類、吡嗪類和呋喃類等主要風味物質的種類和含量,從而提高蠶蛹呈味肽的整體風味。

本文沒有涉及蠶蛹脫脂處理的風味研究,有待進一步試驗研究蠶蛹脂肪對呈味肽風味的影響。