一株產γ-PGA的芽孢桿菌的 分離鑒定及發酵條件的優化

李晨霞,梁 晶,孫麗慧

(大連理工大學食品與環境學院,遼寧盤錦 124221)

γ-聚谷氨酸(γ-glutamic acid,簡稱γ-PGA),是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體，通過γ-酰胺鍵連接而成的一類均聚氨基酸[1],最先發現于炭疽桿菌的莢膜中[2]。γ-PGA是一種水溶性、可被生物降解、不含毒性的大分子聚合物,其分子鏈上大量游離的羧基,使其具有羧基聚合物的普遍性質。此外,大量活性位點使它便于進行材料的功能化[3-4]。聚谷氨酸的應用范圍十分廣泛,分為化妝品級、食品級、藥品級、水處理級、土壤、植物調節劑級等[5-6]。尤其在注重環保、強調可持續發展的社會大環境下,由生物合成的可降解功能型材料γ-PGA,正日益受到人們的關注,逐漸地應用于醫藥制造[7]、食品加工、果蔬產品、海產品的防凍和保鮮,以及化妝品工業及植物種子保護等許多領域,是一種開發價值大、應用前景廣闊的多功能新型生物材料[8],具有重要的研究價值。

目前合成γ-PGA的方法有化學合成法和生物合成法[9-10]。利用微生物發酵合成γ-PGA具有其獨特的優點,例如:經濟高效、對環境污染小、反應條件溫和等。在γ-PGA的微生物發酵生產中,培養基的組成以及對發酵條件的控制都會顯著影響γ-PGA的分子結構組成、相對分子量以及產率。盡管國內外眾多學者已經在發酵法生產γ-PGA上取得了很多的研究成果,但目前研究中仍存在著一些不足之處,或是底物谷氨酸鈉的利用率低;或是發酵產量比較低,這些問題都不利于γ-PGA的工業化生產。

本文從豆腐作坊周邊的土地取樣,篩選獲得一株高產γ-PGA的暹羅芽孢桿菌,并通過單因素實驗和響應面法對其發酵條件進行優化,提高了γ-PGA的產量和轉化率,為發酵生產γ-PGA的工業化提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣品 遼寧省某村莊豆腐作坊周邊的土壤取樣,表層土,下挖5 cm和10 cm的土;PCR擴增細菌16S rDNA的試劑盒、PCR裂解液 寶生物工程(大連)有限公司;革蘭氏染色液試劑盒 青島海博生物技術有限公司;牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂、D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖 北京奧博星生物技術有限責任公司;味精(谷氨酸鈉含量≥99%) 紅梅味精有限公司;玉米漿 實驗室自制;其他試劑 均為分析純。

梅里埃VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定儀 法國梅里埃公司;麥氏比濁儀 法國梅里埃公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HPX-9272MBE電熱恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司;ZWY-1102C恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 重慶東悅儀器有限公司;光學顯微鏡 寧波永新光學股份有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 分離平板培養基(g/L):Na3C6H5O716,C5H8NO4Na 40,NH4Cl 7,K2HPO40.5,MgSO40.5,CaCl20.16,MnSO40.104,FeCl30.104,酵母膏5,瓊脂20,甘油16,pH7.0～7.4,115 ℃滅菌20 min;液體發酵培養基(g/L):C5H8NO4Na 80,NH4Cl 7,MgSO40.5,K2HPO40.5,MnSO40.104,CaCl20.05,葡萄糖45,胰蛋白胨40,酵母膏20,pH7.0,115 ℃滅菌20 min;種子培養基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 5,pH7.0,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的篩選 取適量土樣加入30 mL無菌水中,充分振蕩后靜置2 h,取上層清液100 μL,與900 μL無菌水混合均勻,按此方法進行濃度梯度稀釋,選擇進行涂布的稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7,每個稀釋度涂3個平板作為平行,每個平板接種200 μL,37 ℃培養24 h。待平板長出菌落,對長勢較好的單菌落進行編號,依次接種到液體發酵培養基中,37 ℃,220 r/min培養36 h。參照文獻[11]的方法測定γ-PGA的產量,檢測發酵液中γ-PGA的含量,選取γ-PGA含量最高的菌株，進行進一步純化至純種并保藏,以待后續研究。

1.2.3 菌株的保藏 按2%的接種量[9],將上述發酵液接種至種子培養基中,37 ℃,220 r/min培養18 h。將種子培養基與40%的甘油1∶1混合,于-20 ℃冷凍保藏。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 菌落形態觀察 用肉眼觀察分離平板培養基上的菌落形態,然后挑取少量菌落于載玻片進行革蘭氏染色,用油鏡觀察。

1.2.4.2 分子生物學鑒定 16S rDNA序列擴增與分析 挑取培養基上的菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心(12000×g 4 ℃,30 min)取上清作為模板,反應條件:80 ℃,15 min;然后使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)進行PCR擴增目的片段,經瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收目的片段,由寶生物工程(大連)有限公司進行測序,通過NCBI數據庫在線BLAST系統進行序列比對,以確定種屬。

系統發育樹的構建:使用BLAST將16S rDNA測序結果在NCBI(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)上比對,在比對結果中選擇模式菌株,據同源性搜索結果,使用MEGA 5.0生物學軟件,對測試菌株和相關菌株的多個序列進行比對分析及Neighbor-Joining方法構建系統發育樹。

1.2.4.3 生理生化鑒定 挑取純化的菌株加至3 mL生理鹽水中,振蕩混勻后，利用麥氏比濁儀測定菌懸液濁度達到1.80-2.20麥氏濃度,按照BCL芽孢桿菌鑒定卡的操作說明書，進行VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統分析。

1.2.5 單因素實驗 分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖為碳源,每種碳源的加入量為40 g/L;分別以牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏為氮源,每種氮源的加入量為40 g/L,于37 ℃、pH7.0,220 r/min恒溫振蕩培養36 h,考察不同碳、氮源對γ-PGA轉化率的影響。接著分別探究最適碳、氮源的濃度在30、35、40、45、50、55、60、65、70 g/L時,于37 ℃、pH7.0,220 r/min恒溫振蕩培養36 h,考察γ-PGA的轉化率的變化。以溫度(25、30、35、40、45 ℃),pH7.0,轉速220 r/min;pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),溫度 37 ℃,轉速220 r/min;轉速(160、180、200、220、240 r/min),溫度37 ℃,pH7.0,于1.2.1的液體發酵培養基,振蕩培養36 h,測定其γ-PGA的產量,考察溫度、pH、轉速對γ-PGA的產量的影響。以底物谷氨酸鈉濃度(20、30、40、50、60 g/L),其余均與1.2.1所示的液體發酵培養基相同,溫度37 ℃,pH7.0,轉速220 r/min振蕩培養36 h,考察底物濃度對γ-PGA轉化率的影響。按1.2.2所述方法測得γ-PGA的產量,采用下列方程計算轉化率。所有實驗均重復3次。

γ-PGA轉化率(%)=發酵液γ-PGA質量濃度(g/L)/底物質量濃度(g/L)×100

1.2.6 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,選取溫度、pH、轉速及底物濃度這四個因素作為多因素交叉組合實驗的考察因素,以γ-PGA的產量作為響應值,利用響應面中的Box-Behnken Design方法設計實驗,實驗組合的因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken中心組合實驗設計因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數據處理

單因素實驗結果用Design-Expert 8.0 軟件進行分析處理,采用origin Pro 8.0進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 高產γ-PGA菌株的篩選

利用分離平板培養基共檢出12個菌株,通過觀察菌落形態,初步確定這些菌株為芽孢桿菌。將上述獲得的菌株分別進行搖瓶培養,發酵條件為37 ℃,220 r/min,培養36 h,利用參考文獻[11]所示方法，檢測發酵液中γ-PGA的含量,結果如表2所示。

由表2可知,不同芽孢桿菌產γ-PGA的能力不同,從表層土中篩選出的菌株(以B開頭的編號)產γ-PGA的能力要明顯好于從下挖5 cm(以X5開頭的編號),下挖10 cm(以X10開頭的編號)的土樣中篩選出的菌株,菌株B-6578產γ-PGA的能力相對較高,達到17.53 g/L,因此將其進一步分離純化,保藏待用。

表2 不同發酵液中γ-PGA含量比較結果Table 2 Comparison of γ-PGA production after fermentation by different bacillus

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態學觀察 將菌株B-6578在固體培養基上培養36 h后,菌株在平板上的單菌落呈圓形,隆起,表面有褶皺,濕潤,不透明,邊緣不齊,顏色為淡黃色(圖1a),革蘭氏染色鑒定為陽性菌(圖1b),呈桿狀。

圖1 菌株B-6578菌落形態(a)和革蘭氏染色鏡檢結果(b)Fig.1 Colony morphology(a)and Gram-stain microscopic examination(b)of strain B-6578

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析 以菌株基因組DNA為模板，經過PCR擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳,目的片段大約為1500 bp,將PCR產物回收純化后測序,確定該片段實際長度為1513 bp。該序列已提交Genbank,登記號為MG066538。將該序列在NCBI中Blast比對發現,菌株與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis),解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的同源性極高,序列相似性達到99%。使用分子軟件MEGA 5.0對B-6578相似度較高的菌株進行多序列比對分析,并利用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹(圖2)。由圖可以看出,芽孢桿菌B-6578與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)同源性最高,結合生理生化鑒定實驗結果(表3),鑒定為暹羅芽孢桿菌。

圖2 芽孢桿菌B-6578基于16S rDNA序列及Neighbor-Joining法構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacillus strain B-6578 using neighbor-joining based on 16S rDNA

表3 菌株B-6578生理生化實驗鑒定結果Table 3 Identification results of physiological and biochemical test of strain B-6578

暹羅芽孢桿菌對禾谷鐮刀菌有很好的拮抗作用,禾谷鐮刀菌可引起小麥赤霉病,導致小麥產量的大幅降低和品質的嚴重損失。因此,在農業生產中,暹羅芽孢桿菌可提高植株抗病能力[14-16]。更為重要的是,尚未見該菌株在γ-PGA生產領域的相關報道,因此,本文對暹羅芽孢桿菌產γ-PGA的發酵條件進行優化。

2.3 單因素實驗

2.3.1 不同碳源對發酵的影響 在基礎培養基的基礎上,分別以40 g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖作為碳源,考察不同碳源對發酵的影響(圖3)?？傮w來看,菌體利用淀粉、蔗糖的能力較差,生長受到一定程度的抑制;葡萄糖、麥芽糖、果糖均顯示了較好的γ-PGA的生產性,綜合考慮生產成本和原料來源這兩個因素[18-19],選擇葡萄糖為最佳碳源。進一步研究初始葡萄糖濃度為30～70 g/L對發酵的影響(圖4)。結果顯示,隨著葡萄糖濃度的增加,發酵液中γ-PGA的終濃度逐漸增加。而在初始葡萄糖濃度為45 g/L時,γ-PGA的轉化率最高,而后,隨著初始葡萄糖濃度的增加,γ-PGA的轉化率反而出現下降的趨勢。這可能是由于在高濃度糖基質中,發酵液滲透壓增加,從而對菌體生長及其代謝造成一定的抑制作用。因此為了獲得較高的γ-PGA轉化率,避免高糖濃度對微生物造成的抑制作用,考慮選擇發酵初始葡萄糖濃度為45 g/L,進行發酵培養。

圖3 碳源種類對發酵γ-PGA的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the fermentation γ-PGA

圖4 葡萄糖濃度對發酵產γ-PGA的影響Fig.4 Effects of different glucose concentrations on the production of γ-PGA

2.3.2 不同氮源對發酵的影響 在基礎培養基的基礎上,分別以40 g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿[10]、酵母膏作為氮源,考慮氮源種類對發酵產γ-PGA的影響(圖5)。從圖5中可以看出,胰蛋白胨和酵母膏的γ-PGA的轉化率明顯高于其他氮源,這可能是因為胰蛋白胨和酵母膏中氨基氮的含量均大于3%,可以滿足微生物生長和代謝的需要。因此,采用胰蛋白胨與酵母膏2∶1的復合氮源進行發酵[20-21],有利于芽孢桿菌的生長。進一步研究當該復合氮源初始濃度為30～70 g/L對發酵的影響(圖6),結果顯示,初始復合氮源濃度為40 g/L時,γ-PGA的轉化率最高,因此,以胰蛋白胨和酵母膏的比為2∶1的復合氮源的最適濃度為40 g/L。

圖5 氮源種類對發酵γ-PGA的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the fermentation γ-PGA

圖6 復合氮源不同濃度對發酵產γ-PGA的影響Fig.6 Effect of different compound nitrogen source concentrations on the production of γ-PGA

2.3.3 溫度對發酵的影響 溫度對發酵產γ-PGA的影響結果如圖7所示。可見,當溫度為35 ℃時,芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA的產量最高,為20.39 g/L。溫度過高或過低不僅對菌株的正常生長有影響,而且發生反應所需要的酶在高溫下失活,在低溫下活性受到較大的抑制,從而導致γ-PGA的產量降低。而梁金鐘等[22]在利用枯草芽孢桿菌時發現，菌株在37 ℃時,γ-PGA的產量最高,與本文的結果基本相近。因此,本研究選擇35 ℃作為進一步發酵培養的溫度。

圖7 溫度對B-6578合成γ-PGA的影響Fig.7 Effect of temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.4 pH對發酵的影響 適宜的pH是菌株生長的必要條件,更重要的是會影響菌株的代謝途徑,從而起到調控代謝的作用。通過對pH優化發現(圖8),隨著初始pH的不斷增加,芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA的量也在不斷增加,當初始pH達到7時,產量最大,為17.28 g/L,之后隨著初始pH的繼續增加,γ-PGA的產量卻逐漸降低。另外,該菌株在pH為6～8時,能保持較好的生長,而任尚美等[10]和Feng等[23]結果均表明，pH為7時,γ-PGA的產量最高,與本文結果相符。因此,選擇pH為7作為進一步發酵的pH。

圖8 pH對B-6578合成γ-PGA的影響Fig.8 Effect of pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.5 轉速對發酵的影響 搖床的轉速和裝液量影響著發酵液中溶解氧的含量,這對于好氧微生物的發酵是一個重要因素,產γ-PGA的暹羅芽孢桿菌是好氧菌,且在γ-PGA這種高黏度的發酵體系中尤為突出,γ-PGA的產量與氧的傳遞和料液的氧密度緊密相關,當裝液量為50 mL/250 mL時，發酵產量最高[24]。

通過對轉速的研究發現(圖9),當轉速大于200 r/min時,γ-PGA的產量較高,轉速較低時,由于發酵液的黏度較高,含氧量低,不利于菌株的生長,γ-PGA的產量也就較低。因此,選擇轉速200 r/min進行進一步發酵。

圖9 轉速對B-6578合成γ-PGA的影響Fig.9 Effect of rotational speed on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.6 底物濃度對發酵的影響 底物谷氨酸鈉對γ-PGA合成的影響如圖10,可以看出,隨著谷氨酸鈉濃度的增大,γ-PGA的轉化率也逐漸增大,當谷氨酸鈉濃度變為40 g/L時,γ-PGA的轉化率最大,為44.78%,之后隨著谷氨酸鈉濃度的繼續增大,γ-PGA的轉化率反而出現下降?？梢?底物濃度過高時,可能會降低參與反應的酶活,從而導致實際轉化率降低[25]。在芽孢桿菌發酵產γ-PGA的途徑中,作為底物的谷氨酸鈉的濃度至關重要。濃度過低,菌株不能充分發揮催化轉化的能力,濃度過高則會造成轉化率低,使成本增加。任尚美等[10]通過正交實驗發現,谷氨酸鈉用量對γ-PGA產量的影響最大。因此,選擇谷氨酸鈉的濃度為40 g/L進行進一步發酵。

圖10 底物濃度對B-6578合成γ-PGA的影響Fig.10 Effect of substrate concentration on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.4 響應面優化芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA條件

2.4.1 響應面試驗設計及結果 根據Box-Behnken 中心組合設計原理,選擇溫度、pH、轉速、底物濃度為優化參數,以產量為響應值,對芽孢桿菌B-6578發酵產γ-PGA實驗進行四因素三水平響應面設計,結果見表4。采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行二次多項回歸擬合,回歸結果與方差分析見表5,得到目標響應值與各因素關系的二階經驗模型:

表4 Box-Behnken實驗設計及結果Table 4 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

表5 Box-Behnken實驗方差分析Table 5 Variance analysis of Box-Behnken experiment

R1=26.14-0.64A+1.32B+1.67C+4.76D-0.23AB+0.34AC-1.20AD+1.17BC+3.62BD+0.36CD-6.56A2-9.74B2-5.18C2-4.52D2

式中:R1為γ-PGA的產量(g/L),A、B、C、D分別為溫度(℃),pH,轉速(r/min),底物濃度(g/L)。

2.4.2 各因素交互作用分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應面圖及等高線圖(圖11～圖16),等高線圖可以直觀的反映各因素之間交互作用的強弱,橢圓表示兩因素交互作用明顯,而圓形則表示交互作用較小或沒有交互作用[12-13]?？梢?隨著各因素水平的升高,γ-PGA的產量先增加后減少,底物濃度和pH之間的交互作用如圖12所示,響應面曲面的坡度陡峭,等高線呈橢圓形,說明產量對底物濃度和pH的變化比較敏感,底物濃度和pH之間交互作用較強,對產量的影響顯著(p=0.0245<0.05)。而底物濃度和溫度、pH和溫度、轉速和溫度、轉速和pH、底物濃度和轉速之間的交互作用如圖11、13、14、15、16所示,響應面的坡度較為平緩,等高線近似圓形,所以底物濃度和溫度、pH和溫度、轉速和溫度、轉速和pH、底物濃度和轉速之間的交互作用較弱,但也對芽孢桿菌B-6578產γ-PGA具有一定的影響。

圖11 底物濃度和溫度對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.11 Effect of substrate concentration and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖12 底物濃度和pH對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.12 Effect of substrate concentration and pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖13 pH和溫度對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.13 Effect of pH and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖14 轉速和溫度對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.14 Effect of rotational speed and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖15 轉速和pH對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.15 Effect of rotational speed and pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖16 底物濃度和轉速對芽孢桿菌 B-6578發酵產γ-PGA的影響Fig.16 Effect of substrate concentration and rotational speed on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.4.3 最優發酵條件及驗證 結合響應值與各因素關系的二階經驗模型及三維響應面圖,確定溫度、pH、轉速、底物濃度的最佳優化水平分別為37.5 ℃、pH7.48、240 r/min、52.70 g/L,預測γ-PGA的產量為23.96 g/L,采用該優化發酵條件進行實驗,得到實際γ-PGA的產量為24.82 g/L(實驗重復3次,SD=0.1068)。γ-PGA的轉化率為47.10%,比優化前提高了25.19%。

3 結論

本實驗從豆腐作坊周邊的表層土中篩選出一株產γ-PGA的菌株,通過菌落形態和分子生物學分析,可確定該菌株為暹羅芽孢桿菌。本實驗所采用的菌株B-6578,初始γ-PGA的產量為17.53 g/L,γ-PGA的轉化率為21.91%,通過單因素實驗和響應面實驗優化,采用溫度37.5 ℃,pH7.48,轉速240 r/min,底物谷氨酸鈉濃度52.70 g/L的條件,測得γ-PGA的產量為24.82 g/L,該結果與模型預測的結果吻合較好,因此,優化后γ-PGA的轉化率為47.10%,比優化前提高了25.19%。