甘肅傳統漿水發酵過程中 產雙戊烯乳酸菌的分離篩選

蔡苗苗,贠建民,何大星,李芳霞,王永朝

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

漿水是我國西北地區傳統蔬菜發酵的酸性調味食品,其氣味清香,口味酸醇,含有豐富的益生菌群,營養價值高,夏天可清熱解暑,具有開胃止渴、調理臟腑和降血壓等功效[1]。研究表明,漿水菜發酵過程中以乳酸發酵為主,其優勢菌為乳酸菌(Lactobacillus)[2]。由于乳酸菌不只具有調節人體微生態平衡、降低膽固醇和增強免疫力等重要功能,還可增加食品養分、改善食物風味、調整腸道菌群、清除機體體內有毒物質等諸多保健作用[3-4],其被廣泛應用于食品發酵[5],因而乳酸菌菌株的發酵性能將直接影響漿水的風味與品質[2,5]。

近年來,我國對漿水的研究主要集中在微生物的分離鑒定[6-8]、發酵過程中亞硝酸鹽的控制[9-10]、發酵工藝[11]以及營養成分的研究[11-12]等方面,而在篩選適合于漿水發酵的優良增香乳酸菌株方面的研究鮮見報道。為此,本試驗擬以甘肅天水傳統釀制漿水為原料,采用經典的微生物分離方法,篩選高產漿水特征風味物質——雙戊烯的乳酸菌,以期為漿水產品實現工業化提供菌株來源,為漿水傳統釀制過程中定向調控風味物質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漿水 甘肅天水孟菇食品生物有限公司；雙戊烯標準品 美國Sigma公司;葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖 生化試劑,天津市光復精細化工研究所;吐溫-80、NaCl、NaOH、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、KNO3、(NH4)H2SO4、MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O 分析純,天津市光復精細化工研究所;酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉 生化試劑,北京奧博星生物技術有限公司;CaCO3分析純,天津市大茂化學試劑廠;石油醚 分析純,天津市福晨化學試劑廠。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HZQ-X100A恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;PHS-25型數顯pH計 上海精密科技儀器廠;SZ51型光學顯微鏡 日本Olympus公司;JRA-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;GC-MS聯用儀 美國Agilent scientific公司;U-3010紫外可見分光光度計 Hitachi公司;YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司;FA1204B 型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司;BCD-208BSC冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 MRS液體培養基:葡萄糖20 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,乙酸鈉5 g,檸檬酸二胺2 g,吐溫-80 0.1 mL,MnSO40.28 g,MgSO40.58 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2～6.5,121 ℃滅菌20 min[8]。

發酵培養基:葡萄糖20 g,馬鈴薯50 g,番茄汁70 g,胰蛋白胨15 g,KH2PO410 g,蒸餾水 1000 mL。

1.2.2 漿水的采集 用火焰灼燒后的潔凈取樣勺，采集漿水樣品500 mL,將漿水上清液分別裝入10支50 mL無菌離心管中,低溫下運回實驗室,置于4 ℃低溫冰箱中,保存備用。

1.2.3 富集培養 準確吸取1 mL樣品,緩慢注入配制好的MRS液體培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。

1.2.4 乳酸菌的分離純化 將上述富集好的菌液分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的溶液,再吸取其中稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液各100 μL，涂布于加入了2% CaCO3的MRS瓊脂培養基上,于37 ℃下恒溫培養24 h。篩選有透明圈及乳白色、表面光滑的圓形菌落制片,經革蘭氏染色和鏡檢為G+菌的菌株在MRS培養基上反復劃線純化,鏡檢,直至得到純菌落[2]。將純化后的菌株接種于MRS斜面培養基中,繼續于37 ℃恒溫培養24 h后，保存于4 ℃低溫冰箱中。

1.2.5 產雙戊烯乳酸菌的初篩

1.2.5.1 雙戊烯標準曲線的測定 精確吸取25 μL的雙戊烯標準樣品,以石油醚為溶劑，定容至25 mL容量瓶中,得1 μL/mL雙戊烯標準溶液。取雙戊烯標準溶液于1 cm石英比色皿中,同時以石油醚作為參比,用紫外可見分光光度計在200～300 nm波長范圍內掃描,繪制出吸光度與波長的關系曲線后,以圖像中最大吸光度對應的波長，作為雙戊烯標準溶液的最大吸收波長[13]。分別準確移取1 μL/mL的雙戊烯標準溶液0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL的容量瓶中,用石油醚定容至刻度線,并以石油醚為參比,分別在最大吸收波長處測定其吸光度,繪制標準曲線。

1.2.5.2 產雙戊烯乳酸菌的初篩 在250 mL的三角瓶中倒入50 mL液體發酵培養基,滅菌后接種上述分離純化的菌株,于37 ℃條件下恒溫培養24 h后活化2代,再按5%(v/v)接種量注入初始發酵培養基中,30 ℃避光培養72 h。發酵結束后,取5 mL發酵液于三角瓶中并加入30 mL石油醚,避光振蕩萃取3 h,設置離心機的轉速為6000 r/min,離心10 min后[14],取上清液進行紫外檢測。將未接入菌種的與發酵培養基同批次滅菌的初始培養基以相同方法培養、萃取和定容,以所得的萃取液為參比液,用紫外可見分光光度計在200～300 nm波長范圍內掃描樣品,觀察215 nm波長處是否有特征吸收峰,實驗重復三次[13,15]。根據吸光度值比較發酵液中雙戊烯的含量,篩選出產雙戊烯水平較高的5株菌進行復篩。

1.2.6 產雙戊烯菌株的復篩 配制濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L的雙戊烯標準溶液。用微量進樣器分別準確吸取上述各個濃度的標準溶液5 μL，于氣相色譜儀的進樣口進樣。取經離心過后發酵液的上清液稀釋至適當倍數,以環己酮為內標物,石油醚為萃取劑,進行萃取后通過GC-MS分析定量。

在獲取作物光譜后，經過光譜異常篩選、光譜變換和光譜定量化計算處理。對不同作物冠層反射率數據進行高光譜特征參數提取、植被指數計算等預處理的基礎上進一步分析不同作物參數對比，尋找不同作物識別的敏感參數。

色譜條件:色譜柱(TG-WAX,60 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氦氣,流量1.0 mL/min;升溫程序:初始溫度40 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min升至180 ℃,保留10 min。

質譜條件:接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,離子化方式EI+,電子能量70 eV,掃描質量范圍50～450 amu。經計算機在Nist及Wiley標準譜庫的檢索對比,通過計算機相應的保留指數對比,匹配度大于700(最大值為1000)進行確認[16]。

1.2.7 乳酸菌的初步鑒定

1.2.7.1 菌株產乳酸的鑒定 將分純菌株接種于MRS液體培養基中，在37 ℃下恒溫培養24 h，發酵后,取10 mL發酵液,加入潔凈試管中,先滴加1 mL 10%硫酸,再加入1 mL 2%高錳酸鉀。取濾紙一條在含氨的硝酸銀溶液中浸濕后搭在試管口上,逐漸加熱試管至沸騰,使其中的乙醛散發,仔細觀察,若試管口的濾紙變黑,則證明該菌株發酵可產生乳酸[17]。

1.2.7.2 形態學鑒定 將以上分純的菌株接種在MRS瓊脂培養基上,于37 ℃恒溫培養24 h,觀察菌落的顏色和外形特征,并篩選單菌落制片,進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察乳酸菌形態[18]。

1.2.7.3 生理生化鑒定培養基 硝酸鹽培養基:葡萄糖20 g,酵母膏0.2 g,KNO37.8 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃滅菌20 min。

硫化氫實驗培養基:牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,半胱氨酸0.5 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.4,121 ℃條件下滅菌20 min。

石蕊牛乳實驗培養基:2.5%石蕊水溶液4 mL,脫脂牛奶100 mL,121 ℃下滅菌20 min。

檸檬酸鹽實驗培養基:檸檬酸鈉2.0 g,K2HPO4·3H2O 1.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 5.0 g,(NH4)H2SO41.0 g,溴百里酚藍1%水溶液10 mL,瓊脂12.0 g,蒸餾水990 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

糖發酵基礎培養基:蛋白胨20 g,糖(分別以葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖作為碳源)10 g,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1 mL,NaCl 5 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃滅菌20 min[19]。

1.2.7.4 生理生化鑒定試驗 參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[20]、《伯杰細菌鑒定手冊》[21],對高產酸乳酸菌進行硝酸鹽試驗、過氧化氫酶試驗、石蕊牛乳試驗、產硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗、pH=9.6和pH=4.6生長試驗、糖發酵等試驗進行鑒定,具體方法如下:

a.硝酸鹽還原試驗:將分純菌株接種于上述硝酸鹽液體培養基中,分別于37 ℃恒溫培養箱中培養1、3、5 d,各做三個重復,兩管不接菌作空白對照。詳細實驗步驟為:取兩支滅菌的空試管，并倒入少量各培養了1、3、5 d的培養液,各加1滴A液(對氨基苯磺酸0.8 g+100 mL 5 mol/L醋酸)與B液(α-奈胺0.5 g+100 mL 5 mol/L醋酸),對照組也加入A液與B液各1滴。之后,溶液若變成玫紅色、粉紅色、橙色或棕色等表示亞硝酸鹽存在,則是硝酸鹽還原陽性反應;若無紅色出現,再加1～2滴二苯胺試劑,此時若呈現藍色,則表示培養液中也有硝酸鹽,但無亞硝酸鹽,表示無硝酸鹽還原反應,若未呈現藍色,表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已被還原成其他物質,故還是硝酸鹽還原陽性反應。

b.過氧化氫酶試驗:取分純菌株的菌落于清潔載玻片上,滴加3% H2O2溶液并觀察結果,若30 s內產生氣泡者則為陽性,反之則為陰性。

c.石蕊牛乳試驗:在石蕊牛乳培養基中接種分純菌株,于37 ℃條件下恒溫培養7 d,同時作空白對照,兩個重復。7 d后,取出培養物并觀測接種菌株的生長變化現象。

d.硫化氫試驗:將分純的菌株接種于上述培養基中,用滅菌鑷子取乙酸鉛紙條一條垂掛在試管內,紙條下端靠近培養基表面,但不能接觸培養基液面,試管上端用塞子塞緊,同時以不接菌的試管做空白對照,并做兩組重復。35 ℃恒溫培養24～48 h后觀察試管內紙條是否變黑,變黑者記為陽性,不變者記為陰性。

e.檸檬酸鹽試驗:在斜面上用劃線接種法接種分純的菌株,于37 ℃下培養3 d到7 d并觀察,若培養基中指示劑顯色為藍色或桃紅色則為陽性,否則為陰性。

f.pH9.6和pH4.6生長試驗:將菌種分別接于pH為9.6和pH為4.6的MRS液體培養基中,做兩組重復,于37 ℃培養2 d,仔細觀察菌株的生長現象。

g.糖發酵試驗:將分純的菌株接種于糖發酵液體培養基中的杜氏套管內,并設空白對照,28 ℃恒溫培養,次日開始觀察,一直到第7 d。判定實驗結果,若小管內有氣體產生記為陽性,不產氣者記為陰性。做兩組重復。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件整理分析實驗數據,以及進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從漿水樣品中共分離出100株乳酸菌,編號為R-1～R-100,純化后的菌株均保藏于斜面上。

2.2 初篩結果

2.2.1 最大吸收波長的測定 由圖1可知,用紫外可見分光光度計，在200～300 nm波長范圍內掃描雙戊烯標準溶液時，出現了最大吸收峰,此時雙戊烯標準溶液的吸光度最大,其對應的波長為215 nm,因此，雙戊烯標準溶液的最大吸收波長為215 nm。

圖1 雙戊烯標準溶液紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of dipentene standard solution

2.2.2 雙戊烯的標準曲線 按照1.2.5.1的方法操作,以吸光度(A)為縱坐標,雙戊烯標準液的濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線(圖2),得線性回歸方程:y=40x-0.2(R2=1),表明該實驗方法合理,實驗具有較高的可信度,可以采用該線性關系來計算發酵液中雙戊烯的濃度。

圖2 雙戊烯標準品的標準曲線Fig.2 Standard curve of dipentene standard

2.2.3 初篩結果 結合分離純化及1.2.5.2紫外檢測發酵液產雙戊烯的結果(見表1),選取有透明圈、表面光滑的乳白色菌落、革蘭氏染色為G+的菌株共8株:R-14、R-17、R-3、R-32、R-8、R-12、R-23、R-40,以其中產雙戊烯最高的五株菌株R-14、R-17、R-3、R-32和R-8作為初篩菌株進行后續復篩。

表1 產雙戊烯乳酸菌的分離篩選Table 1 Isolation of producing-dipentene lactic acid bacteria strains

2.3 復篩結果

2.3.1 線性關系考察 按照1.2.6的方法,以雙戊烯濃度為橫坐標,以雙戊烯與內標物的響應值之比為縱坐標,繪制標準曲線(圖3),計算得回歸方程:y=0.0052x+1.372(R2=0.9992),結果表明，雙戊烯進樣濃度在10～50 mg/L范圍內,進樣濃度與雙戊烯和內標物的響應值之比呈良好的線性關系。

圖3 GC-MS測定雙戊烯的標準曲線Fig.3 Standard curve of dipentene standard by GC-MS

2.3.2 復篩結果 采用GC-MS方法,對上述R-14、R-17、R-3、R-32和R-8五株初篩菌株，在馬鈴薯番茄液體培養基中發酵產雙戊烯的測定結果中可以看出,只有R-32在發酵液中檢出產雙戊烯,出峰時間是15.35 min,峰面積比為0.38%(結果見圖4),雙戊烯含量為0.171 μg/mL,故確定乳酸菌R-32為漿水發酵產雙戊烯的優良菌株。

圖4 菌株R-32產雙戊烯的總離子流譜圖Fig.4 Total ion chromatograms of GC-MS for producing-dipentene strain R-32

2.4 乳酸菌的鑒定結果

2.4.1 菌株產乳酸的鑒定結果 按1.2.7.1的方法,觀察試管口濾紙是否變黑,發現試驗組試管口的濾紙變黑,對照組試管口的試紙未發生明顯變化(結果如圖5),表明菌株R-32的發酵液中有乳酸,當發酵液中加入10%硫酸和2%高錳酸鉀時乳酸就會轉化為乙醛,再加熱試管至沸騰時,乙醛散發會與濾紙條上含氨的硝酸銀進一步發生反應使濾紙條變黑。

圖5 菌株產乳酸的定性試驗Fig.5 Result of qualitative test on lactic acid production

2.4.2 乳酸菌的形態學特征 按照1.2.7.2的方法,觀察純化后菌株R-32的菌落形態,結果見圖6、表2;革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察染色結果及菌體形態,結果見圖7、表2。

圖6 菌落特征圖Fig.6 Colony characteristics

圖7 乳酸菌R-32Fig.7 Lactic acid bacteria R-32

表2 純菌的菌落及形態特征Table 2 Clone characterization of purified microorganisms

2.4.3 生理生化特性鑒定結果 按照1.2.7.4的方法對菌株R-32進行生理生化鑒定試驗,結果如表3所示。

表3 菌株的生理生化實驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical characteristics of R-32 strain

根據《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[20]、《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21],結合菌株產乳酸定性實驗及形態學觀察結果,對比張軼等[4]、張敏等[22]、孔彥卓等[23]的研究結果,乳酸菌菌株R-32符合腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)的生物學特性,故菌株R-32初步鑒定為腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。

3 結論

本文采用經典的微生物分離方法,從漿水中分離出1株產雙戊烯的乳酸菌菌株R-32,其在馬鈴薯番茄液體發酵培養基中產雙戊烯含量可達到0.171 μg/mL;根據《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》、《伯杰氏細菌鑒定手冊》,結合形態學觀察結果、測定生理生化指標及產乳酸定性試驗的鑒定,本試驗中篩分得到的乳酸菌菌株R-32與腸膜明串珠菌屬(L.mesenteroides)的生物學特性十分相似,故鑒定可用于傳統漿水發酵的產香乳酸菌株R-32為腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)，本研究中僅分離篩選了漿水中產雙戊烯的乳酸菌,后續可對漿水釀制過程中其他特征風味優良產香菌株的選育做深入研究。